5.000 genç yetişkin Caenorhabditis Elegans solucanından kromatin çapraz bağlama ve çekirdek toplanmasından sonraki ilk gün, 450 mikrolitre temiz suda yeniden askıya alınan çekirdek peletini temiz bir 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra 60 mikrolitre 10X DPN2 kısıtlama enzim tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Numuneleri, ajitasyonla bir saat boyunca 37 santigrat derecede 15 mikrolitre% 10 sodyum dodesil sülfat ile inkübe edin.
75 mikrolitre% 20 triton X 100 ekleyerek ve daha önce gösterildiği gibi inkübe ederek reaksiyonu söndürün. Numuneden 10 mikrolitreyi sindirilmemiş kontrol olarak aliquot edin ve dört santigrat derecede saklayın. Numunenin geri kalanına 400 birim DPN 2 ekledikten sonra, kromatin sindirimi için ajitasyonla gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
İkinci günde, örneğe 200 birim DPN 2 daha ekleyin. Çapraz bağlı numunenin sindirimini tamamlamak için, dört saat boyunca ajitasyonla 37 santigrat derecede inkübe edin. Isı, numuneyi 65 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe ederek kısıtlama enzimini inaktive eder.
Enzim ısı ile inaktive edilemezse, 80 mikrolitre% 10 sodyum dodesil sülfat ekleyin ve inkübe edin. Daha sonra, numuneye 375 mikrolitre% 20 Triton X 100 ekleyin ve dönerek karıştırın. Sindirim kontrolü olarak numuneden 10 mikrolitrelik bir aliquot ayırın.
Kromatin ligasyonu için, numuneyi temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Numune hacmini moleküler sınıf su ile 5,7 mililitreye ayarlayın ve dönerek karıştırın. Ardından, 700 mikrolitre 10 X T4 ligaz tamponu, ardından 60 birim T4 DNA ligaz ekleyin ve numuneyi gece boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin.
Üçüncü günde, protein sindirimi ve ters çapraz bağlama ile devam edin. 3C numunesine mililitre Proteinaz K başına 30 mikrolitre 10 miligram ekleyin ve ajitasyonla gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Dördüncü günde 3C kütüphanesinin saflaştırılmasına başlamak için, numuneye mililitre RNaz A başına 30 mikrolitre 10 miligram ekleyin ve dönerek karıştırın.
Kuluçkadan sonra, numunelere yedi mililitre fenil kloroform ekleyin ve çalkalayarak karıştırın. Numuneyi 3.270 G ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüj edin. Sulu fazı toplayın ve temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Eşit miktarda kloroform ekleyin ve numuneyi çalkalayarak karıştırın. Numuneyi gösterildiği gibi tekrar santrifüj ettikten sonra, sulu fazı başka bir temiz 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. 7.5 mililitre moleküler sınıf su, 35 mililitre% 100 etanol ve mililitre Glikojen başına yedi mikrolitre bir miligram ekleyin.
Düzgün karıştırılmış numuneyi eksi 80 santigrat derecede dondurun. Numune donarken, moleküler dereceli su kullanarak kontrollerin hacmini 500 mikrolitreye ayarlayarak kontrol numunelerini arıtmaya başlayın. Mililitre RNase A başına 10 miligramlık iki mikrolitre ekleyin ve tüpü hareket ettirerek karıştırın.
Daha sonra, kontrolleri içeren tüplere bir mililitre fenil kloroform ekleyin ve çalkalayarak karıştırın. Tüpleri santrifüjleyin. Sulu fazı temiz bir 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktardıktan sonra, eşit miktarda kloroform ekleyin.
Sulu fazı toplamadan önce daha önce gösterildiği gibi santrifüj. Toplanan sulu faza, mililitre glikojen başına bir mililitre etanol ve iki mikrolitre bir miligram ekleyin. Numuneyi çalkalayarak karıştırdıktan sonra, eksi 80 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra, numuneyi dört santigrat derecede 3.270 G'de 15 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, 750 mikrolitre soğutulmuş% 70 etanol ve santrifüj ekleyin. Havada kurutulmuş peleti 50 mikrolitre moleküler dereceli suda tekrar askıya alın.
Süspansiyon, hemen devam etmezse burada dondurulabilir. 3C numune saflaştırmaya devam etmek için, numuneyi dondurucudan çıkarın ve 30 dakika boyunca 3.270 G'de santrifüjleyin. 10 mililitre soğutulmuş% 70 etanol ekleyin ve DNA peletini parçalayın.
Süpernatanı santrifüj ettikten ve çıkardıktan sonra, numuneyi oda sıcaklığında kısmen havalandırın. Pelet, saflaştırılmış 3C kütüphanesini elde etmek için peleti pH 7.5'te 150 mikrolitre 10 milimolar tris HCL'de yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın. Bir deneysel ve iki kontrol 3C numunesi üzerinde gerçekleştirilen QPCR, sindirim verimliliği verilerinin oluşturulmasına yardımcı oldu.
3C örneği, test edilen yedi genomik lokus boyunca yaklaşık% 88'lik bir sindirim verimliliğine sahipti.
