Başlamak için, kıt hücrenin biyotin ile çekilen DNA parçalarını alın. dATP kuyruğu için reaktifleri ekleyerek bir ana karışım hazırlayın ve numuneyi 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, numuneyi 65 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe ederek ve buz üzerinde soğutarak Klenow exo-eksi'yi devre dışı bırakın.
Boncukları TB, NTB ve 100 mikrolitre ligasyon tamponunun her biri 300 mikrolitre ile yıkadıktan sonra, 50 mikrolitre ligasyon tamponunda tekrar askıya alın. Numuneye dört mikrolitre 15 mikromolar önceden tavlanmış adaptör karışımı ve mikrolitre T4 DNA ligaz başına 2000 birimlik bir mikrolitre ekleyin. Boncukları 400 mikrolitre TB, 200 mikrolitre NTB ve 100 mikrolitre kısıtlama tamponu iki ile yıkayın.
Kütüphaneyi PCR ile güçlendirdikten sonra, aynı numunedeki tüm 50 mikrolitre reaksiyonları 1.5 mililitrelik bir DNA düşük bağlanma tüpünde toplayın. Bir tüp mıknatısın üzerine yerleştirin ve tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin. Kütüphaneyi içeren süpernatantı yeni bir 1.5 mililitre DNA düşük bağlama tüpüne aktarın ve TLE tamponu ile 500 mikrolitreye doldurun.
Paramanyetik boncuk saflaştırma kullanarak çift taraflı bir seçim yapmak için, kütüphaneye 200 mikrolitre stok boncuk ekleyin, vorteks ile karıştırın ve oda sıcaklığında dönerek 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, kütüphaneyi bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin. Kütüphaneyi içeren süpernatantı yeni bir 1.5 mililitre DNA düşük bağlama tüpüne aktarın.
Boncukları 750 mikrolitre stok boncuk alarak ve bunları bir mıknatıs üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirerek konsantre edin. Tüm boncuklar duvara yapıştıktan sonra, süpernatantı çıkarın ve boncukları 300 mikrolitre yeni stok boncukta girdap yaparak yeniden askıya alın. Numuneye 300 mikrolitre konsantre boncuk ekleyin.
Vorteks ile karıştırın ve oda sıcaklığında dönerek 10 dakika boyunca inkübe edin. Bir mıknatısın üzerine yerleştirin. Tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin ve süpernatanı çıkarın.
Boncukları hala mıknatısın üzerinde duran boncuklarla tüpe bir mililitre% 70 etanol ekleyerek yıkayın. Boncukların hava ile kurumasına izin verin ve vorteks yaparak 21 mikrolitre TLE tamponunda tekrar askıya alın. Kütüphaneyi boncuklardan çıkarmak için, numuneyi bir termoblokta 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin.
Tüpü bir mıknatısa yerleştirin ve kütüphaneyi içeren süpernatantı yeni bir 1.5 mililitre DNA düşük bağlama tüpüne aktarın.
