Başlamak için, parlak örtü üzerindeki tohum HEK293A hücreleri,% 80 birleşene kadar yüksek glikoz DMEM içeren 24 oyuklu bir plakaya yerleştirilir. Ertesi gün, Earl'ün dengeli tuz çözeltisinde hücreleri iki saat aç bıraktı. İşlemden sonra, ortamı aspire edin ve PBS'ye 500 mikrolitre veya% 4 formaldehit çözeltisi ekleyin ve hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Sabitlemeden sonra formaldehit çözeltisini 500 mikrolitre PBS ile değiştirin. Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'ye 500 mikrolitre 50 milimolar amonyum klorür çözeltisi ekleyerek serbest aldehit grubunu söndürün. Amonyum klorür çözeltisini, hücrelere nüfuz etmek için PBS'de beş dakika boyunca mililitre başına 50 mikrogram digitonin çözeltisinin 500 mikrolitresi ile değiştirin.
Geçirgenlikten sonra, digitonin çözeltisini PBS yıkamayı üç kez tekrarlayan 500 mikrolitre PBS ile değiştirin. Son yıkamadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 mikrolitre bloke edici solüsyonda inkübe edin. İnkübasyondan sonra, engelleme çözeltisini 500 mikrolitre PBS ile değiştirin.
Daha sonra cımbız kullanarak, kapak fişlerini kuyudan toplayın ve ince mendil mendilleri kullanarak fazla PBS'yi çıkarın. Nemlendirilmiş odada, kapak fişini hücre tarafı aşağı bakacak şekilde 50 mikrolitrelik bir primer antikor çözeltisi damlası üzerine yavaşça yatırın. Hücreleri nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, kapak fişlerini toplayın ve fazla primer antikor solüsyonunu boşaltın. Kapak fişlerini hücre tarafı yukarı bakacak şekilde 24 oyuklu plakaya geri yerleştirin ve PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, kapak fişlerini toplayın ve her bir kapak fişini hücre tarafı aşağı bakacak şekilde 50 mikrolitrelik bir ikincil antikor çözeltisi damlasına yerleştirmeden önce fazla PBS'yi boşaltın.
Nemlendirilmiş bir odada bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, fazla ikincil antikor çözeltisini boşaltın ve kapak kızağını 24 oyuklu plakada 500 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Fazla PBS'yi boşalttıktan sonra, her bir kapak fişini hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, nemlendirilmiş bir odada PBS'de bir ila 4.000 oranında seyreltilmiş 50 mikrolitrelik bir kanca çözeltisine yerleştirin.
Nemlendirilmiş bir odada beş dakika inkübe edin. Daha sonra, fazla kanca çözeltisini çıkarın ve kapak fişlerini 24 oyuklu bir plakada üç kez PBS ile ve bir kez deiyonize su ile yıkayın. Fazla deiyonize suyu boşalttıktan sonra, hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek her bir kapak kızağını bir mikroskop lamı üzerine lekelenmiş 10 ila 20 mikrolitrelik bir montaj solüsyonu damlasına yerleştirin.
