ATG9A yapılarının canlı hücre görüntülemesi için, iki mililitre yüksek glikozlu DMEM'deki HEK293A hücreleri, %65 ila 70 birleşmeye ulaşana kadar 60 milimetrelik bir doku kültürü kabına tohumlayın. Ertesi gün, lipofektamin DNA karışımını hazırlayın ve dört mililitre büyüme ortamı içeren hücre kültürü plakasına ekleyin ve karışımı eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe ileri geri sallayın. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 10 karbondioksitte inkübe edin.
Dört saatlik transfeksiyondan sonra, büyüme ortamını taze bir ortamla değiştirin ve hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede% 10 karbondioksit ile inkübe edin. Ertesi gün, tripsin EDTA ekleyerek hücreleri deneyin. Daha sonra, ayrılan hücreleri sayın ve gece boyunca canlı mikroskopi için uygun bir kültür kabında yeniden tohumlayın.
Ertesi gün, hücreleri konfokal bir mikroskop kullanarak görüntüleyin. Bazal koşullarda, ATG9A, endojen proteinin immünofloresansı ile gösterildiği gibi esas olarak Golgi ağında lokalizedir ve bir cis-Golgi belirteci olan GM130 ile örtüşür. eGFP N-terminal etiketli ATG9A ve mRFP N-terminal etiketli ATG9A, Golgi'de daha az lokalize edildi ve esas olarak veziküllerde bulundu.
Buna karşılık, eGFPc terminal olarak etiketlenmiş ATG9A, hücre içinde toplanmaya daha yatkındır. Bir N-terminal florofor ve ATG9A arasında bir 3x-FLAG dizisinin kaynaştırılması, aşırı eksprese edilen proteinin endojen olana benzer şekilde davranmasına yardımcı oldu. Aşırı eksprese edilen mCherry 3x-FLAG ATG9A, beslenen koşullarda Golgi marker GM130 ile birlikte lokalize olur.
Bu lokalizasyon ve AG9A veziküler bölmesi zamanla korunmuş ve ATG9A kaçakçılığının uzay-zamansal çalışmasına izin vermiştir.
