Başlamak için oda ışığını kapatın. FlowView yazılımında oküler panelin altında Oküler'i seçin. Küp tareti dört TRITC olarak değiştirin ve yazılımdaki dokunmatik panel denetleyicisinin arka ışığının altına tıklayarak dokunmatik panel denetleyicisini kapatın.
Ardından bilgisayar ekranını kapatın. Mikroskop üzerindeki siyah bez kapağın ön tarafını açın. Kara kutudan embriyoların bulunduğu 35 milimetrelik cam tabanlı çanağı alın ve mikroskop sahnesine yerleştirin.
Ardından floresan aydınlatma ünitesini açın ve ilgilenilen embriyoyu tanımlamak için göz merceğini kullanın. Odak noktasına getirin. Numuneyi ışıktan korumak için siyah bez kapağını kapatın.
Mikroskobu kontrol eden yazılıma erişmek için bilgisayar ekranını açın. Görüntü elde etmek için yazılımda oküler LSM olarak değiştirin. 25 kat büyütme suya daldırma hedefi kullanarak uyarılmamış embriyoları kontrol etmek için lazer ablasyonu gerçekleştirin.
Araç penceresinden Bright Z, Sequence Manager ve LSM stimülasyonu'na tıklayın. Tarayıcı türünü Galvano ve tarama boyutunu 512 x 512 olarak ayarlayın. 1040 nanometre lazerin kullanımına izin vermek için PMT ayar panelinin altındaki birinci ve üçüncü kanalı açın ve embriyoyu görselleştirmek için dört kat canlı hıza tıklayın.
Ön arka ekseni dikey olarak yönlendirmek için döndürme işlevini kullanarak embriyoyu döndürün ve yakınlaştırmayı üçe ayarlayın. Tarama ayarları altındaki şekil aracını kullanarak ilgilendiğiniz bir bölge veya yatırım getirisi çizin ve referans panelinde yatırım getirisi boyutunu ayarlayın. Ardından, yatırım getirisini 512 piksel genişliğinde ve 100 piksel yüksekliğinde ayarlayın.
Ablasyon öncesi Z yığını için edinim parametrelerini ayarlamak için, embriyonun yüzeyini Z bölümünün altında sıfır olarak kaydedin. Başlangıcı sıfır, bitişi 100 mikrometre olarak ayarlayın. Adım boyutunu iki mikrometre olarak ayarlayın ve seri sekmesi altında Z'yi işaretleyerek Z edinme modunu etkinleştirin.
Parlak Z işlevini kullanarak, 1040 nanometre lazer yoğunluğunu doğrusal olarak %3'ten %7'ye çıkaracak şekilde ayarlayınSıra Yöneticisi'nde LSM'ye tıklayarak mevcut görüntüleme ayarını işlem hattının ilk görevi olarak kaydedin. Ablasyon öncesi film için alım parametrelerini ayarlamak için, daha önce gösterildiği gibi embriyonun ventral yüzeyinin yakınında 512 x 512 piksellik bir ROI ayarlayın. 1.040 nanometre lazer yoğunluğunu %3 olarak ayarlayınKontrol süresi ve seri panelinin altındaki Z işaretinin işaretini kaldırın.
Aralığı hızlandırılmış panelin altında serbest çalışma olarak tutun ve döngüyü 10 olarak ayarlayın. Sıra Yöneticisi'nde LSM'ye tıklayarak geçerli ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin. Lazer ablasyon parametrelerini ayarlamak için, vitellin membranının hemen altında bir 3D bölge tanımlayın.
Z yığınının başlangıcını düzlem olarak ve sonunu 20 mikrometre daha derin olarak ayarlayın. Adım boyutunu 1,5 mikrometre olarak ayarlayın. 920 nanometre lazerin kullanımına izin vermek için PMT ayar panelinin altındaki ikinci ve dördüncü kanalı açın.
Lazerin yoğunluğunu %30'a ayarlayın ve tanımlanan 3B bölge içinde tek bir Z yığını için lazerle görüntü alımını ayarlayın. Sıra Yöneticisi'nde LSM'ye tıklayarak geçerli ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin. Ablasyon sonrası film için çekim parametrelerini ayarlamak için, 1, 040 ve 920 nanometre lazerleri kullanarak 100 kare tek Z düzlemi ablasyon sonrası film için görüntü alımını ayarlayın.
Lazerlerin yoğunluğunu %3 ve %0,3 olarak ayarlayınSıra Yöneticisi'nde LSM'ye tıklayarak mevcut ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin. Al altında sırayı seçin. Veri kaydetme yolunu ve dosya adını gerektiği gibi değiştirin.
Hazır'a tıklayın ve yazılımın işlem hattını başlatmasını bekleyin, ardından işlem hattını yürütmek için başlat'a tıklayın. uyarılmış embriyolarda lazer ablasyon yapmak için, uyarılmamış embriyolar için gösterildiği gibi ön ablasyon Z yığını için edinim parametrelerini ayarlayın. Sıra Yöneticisi'nde LSM'ye tıklayarak geçerli ayarı işlem hattının ilk görevi olarak kaydedin.
Tanımlanmış bir ROI dahilinde optogenetik stimülasyon parametrelerini ayarlamak için, yakınlaştırmayı bir olarak değiştirin ve embriyonun ventral yüzeyini kapsayan bir ROI seçin. Birinci kanaldan dört dedektöre kadar olan kanalı kapatın, LSM stimülasyonuna tıklayın, süre içinde sürekli seçeneğinin işaretini kaldırın ve 12 saniye yazın. Sıra Yöneticisi'nde stimülasyona tıklayarak mevcut ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin.
Miyozin ve apikal F-aktin demontajının tamamen inaktivasyonunu sağlamak ve lazer ablasyonundan önce statik bir doku morfolojisi elde etmek için stimülasyondan sonra üç dakikalık bir bekleme süresi ayarlayın. Daha sonra, görüntü elde etmek için 1.040 ve 920 nanometre lazerlerin kullanılması dışında, uyarılmamış embriyolar için gösterildiği gibi tek Z düzlemi ön ablasyon filmi için edinim parametrelerini ayarlayın. Dört dedektörü kanalize etmek için birinci kanalı açın.
Lazerlerin yoğunluğunu %3 ve %0,3 olarak ayarlayınSıra Yöneticisi'nde LSM'ye tıklayarak mevcut ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin. Uyarılmamış embriyolar için gösterildiği gibi lazer ablasyon için parametreleri ayarlayın. Sıra Yöneticisi'nde LSM'ye tıklayarak geçerli ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin.
Uyarılmamış embriyolar için gösterildiği gibi ablasyon sonrası tek Z düzlemi filmi için edinim parametrelerini ayarlayın. Sıra Yöneticisi'nde LSM'ye tıklayarak geçerli ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin. Al altında sırayı seçin.
Veri kaydetme yolunu ve dosya adını gerektiği gibi değiştirin. Hazır'a tıklayın ve yazılımın işlem hattını başlatmasını bekleyin, ardından işlem hattını yürütmek için başlat'a tıklayın. Apikal daralma geçiren uyarılmamış embriyolarda, spagetti kabağı mCherry medial apikal bölgede zenginleşirken, CRY2Rho bir baskın negatif mCherry sitozolikti.
Uyarılan embriyolarda, CRY2Rho bir baskın negatif mCherry sinyali plazma membranı lokalize olurken, spagetti kabağı mCherry'nin medial apikal sinyali tamamen kayboldu. Daralma alanı içinde uyarılmamış embriyoların lazer ablasyonu, ön arka eksen boyunca hızlı bir doku geri tepmesine yol açarken, uyarılmış embriyolarda lazer ablasyonu, gözle görülür doku geri tepmesine neden olmadı. Ablasyon ölçüldü ve burada gösterildi.
