Normalleştirilmiş sindirilmiş DNA örneklerinin batı lekelenmesine başlamak için 4X Laemmli örnek tamponu ekleyin ve örneği beş dakika kaynatın. Beş ila altı mikrogram sindirilmiş numuneyi %4 ila 20 poliakrilamid jel üzerine yükleyin ve değiştirilmemiş ve translasyon sonrası modifikasyonları veya PMT konjuge DPC'leri çözmek için SDS-PAGE gerçekleştirin. Jeli gece boyunca oda sıcaklığında Coomassie mavi lekesi ile inkübe edin.
Görüntü elde etmeden önce jeli iki saat boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın. Ubikitilasyon, SUMO-1 veya SUMO-2 ve 3 modifikasyonu, ADP ribozilasyonu, toplam TOP1, TOP2 alfa veya TOP2 beta DPC'leri tespit etmek için, ilgili antikorları tabloda gösterildiği gibi seyreltin. Daha sonra, jeli bloke edici tamponda uygun bir primer antikor seyreltmesinde aktarın ve membranları gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Yapıldıktan sonra, geliştirilmiş kemilüminesans reaktifi ile membranı geliştirmeden önce, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bloke edici tamponda 5.000 kat seyreltilmiş ikincil bir antikor ile PBST yıkanmış membranı inkübe edin. Görüntüleme sistemini kullanarak bir görüntü elde edin. Kamptothecin maruziyeti TOP1 DPC oluşumunu indükledi.
TOP1 DPC oluşumu, anti-SUMO-2 ve 3 modifikasyonuna benzer şekilde 20 dakikalık kamptotekin maruziyetinden sonra zirveye ulaştı. SUMO-1 modifikasyonunun ve ubikitilasyonun doruk noktası da gözlendi. DPC'ler ve SUMO-2 ve 3 TOP1 modifikasyonları, kamptotekin dozuna bağlı bir şekilde azalmıştır.
Adiposit kaynaklı TOP2 DPC'ler ve SUMO-2 ve 3 modifikasyonu 20 dakikada zirveye ulaştı ve daha sonra azaldı. Buna karşılık, SUMO-1 ve ubiquitin modifikasyonları 60 dakikada zirve yaptı. Formaldehit kaynaklı DPC'ler ve bunların SUMO-2 ve 3, SUMO-1 ve ubikitilasyonu doza bağlı bir şekilde oluştu ve birikti.
Bir anti-PAR antikoru kullanılarak TOP1 DPC'lerin PARilasyonunun kantitatif tespiti, hücreye bir PARG inhibitörü eklenmedikçe TOP1 DPC PARilasyonu tespit edilemedi, bu da PARilasyonun derhal gerçekleştiğini ve oldukça dinamik olduğunu düşündürdü.
