Başlamak için, sindirilmiş ve genişletilmiş arşivlenmiş veya taze klinik doku örneğini alın ve altı oyuklu bir hücre kültürü plakasının tek bir kuyucuğuna yerleştirerek antikor boyamaya devam edin. Numuneyi PBS ile her biri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Numune boyutuna bağlı olarak, jeli yeterince kaplamak için boyama tamponuna 0.5 ila 2 mililitre primer antikor ekleyin.
Gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, numuneyi oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Karşılık gelen ikincil antikorları ekleyin ve tercih edilen boyama tamponunda 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin.
Numuneyi daha önce gösterildiği gibi yeniden yıkayın ve altı oyuklu bir plakada numuneye 1 ila 2 mililitre polietilen glikol ekleyin. Numuneyi oda sıcaklığında üç saat boyunca Fluor 4 konjuge NHS esteri ile boyayın. İnkübasyonun sonunda, numuneyi PBS ile üç kez yıkayın.
Daha sonra, lipid boyama yapmak için, PBS'de üç kez yıkanmış genleşmiş doku örneğini alın, oda sıcaklığında 72 ila 96 saat boyunca 2 mililitre% 0.1 Triton X-100 veya PBS'de 200 kat seyreltilmiş geleneksel bir lipofilik boya uygulayın ve en az üç kez yıkayın. FISH gerçekleştirmek için 2 x SSC, %10 dekstran sülfat, %20 etilen karbonat ve %0.1 Tween 20'yi birleştirerek hibridizasyon tamponunu hazırlayın. Homojenize jel numunelerini 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir hibridizasyon tamponuna yerleştirin.
Daha sonra, jel örneklerini 45 santigrat derecede gece boyunca hedef gene karşı 10 pikomolar FISH probu içeren bir hibridizasyon tamponu ile inkübe edin. Numuneleri sıkı yıkama tamponu ile her biri 45 santigrat derecede 15 dakika ve 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. Numuneyi PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve numuneyi 4 santigrat derecede PBS artı %0.02 sodyum azid içinde görüntülemeye veya saklamaya devam edin.
Dokuyu tamamen genişletmek ve görüntülemek için, PBS'de dört kat genişletilmiş numuneleri cam tabanlı altı oyuklu bir görüntüleme plakasına taşıyın. Numune daha da genişletilmişse, daha küçük parçalara ayırın. Cam yüzeye% 0.1 polilisin uygulayın.
Numuneyi lam üzerine yerleştirin ve görüntüleme sırasında jel hareketini önlemek için jelin etrafındaki fazla sıvıyı bir kağıt laboratuvar beziyle temizleyin. Daha sonra, geleneksel bir geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskop veya tercih edilen başka bir görüntüleme sistemi kullanarak floresan görüntüleme gerçekleştirin. Görüntülemeden sonra, deiyonize suda uzun süreli depolama floresan sinyalinin bozulmasına yol açtığından, numuneleri PBS'de en az üç adet 10 dakikalık yıkama ile küçültün.
Son olarak, numuneleri 4 santigrat derecede %0,02 sodyum azid içeren PBS'de saklayın. Tamamen genişlemiş fare beyin dokusunun konfokal görüntüleri, proteinlerin ve hücre ve mitokondriyal membran yapılarının görselleştirilmesine izin verdi. Resmi ve sabit parafine gömülü insan lenf nodu dokusunun nükleik asitleri de tanımlandı.
Böbrek bölümünün 3.5 kat genişlemesinden sonra çatlaksız genişlemiş glomerulus görüldü. Bununla birlikte, yetersiz ankraj veya homojenizasyon, başka bir böbrek bölümünde çatlama, bozulma ve etiketli hedeflerin kaybolmasına neden oldu.