Arıları iki mikrolitre 6xHis etiketli rekombinant tütün aşındırma virüsü veya TEV proteaz ile inkübe ederek kromatin tek kopya gen lokusunu saflaştırmak için kullanılan manyetik boncuklardan lexA CBP kromatin halka komplekslerini serbest bırakın. Arıları manyetik bir raf transferi kullanarak son elüattan ayırdıktan sonra, parçalanmış kromatin halkaları içeren eluat, yeni bir 1.5 mililitrelik reaksiyon tüpüne bağlanır. Yine, kalan boncukları nihai elüattan ayırmak için tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin.
DNA ve protein analizi için bazı numuneleri 20 santigrat derecede saklamadan önce boncukları 750 mikrolitre soğuk amonyum karbonat tamponunda yeniden süspanse edin. Son elüattan numuneleri çıkarın ve DNA ve protein analizi için 20 santigrat derecede saklayın. Ayrıca, kalan boncuklardan örnekler alın.
Manyetik boncukları 750 mikrolitre soğuk amonyum karbonat tamponunda her biri 20 dakika boyunca iki kez, dakikada 20 devirde dört santigrat derece döndürerek yıkayarak denatürasyon elüsyonuna başlayın. Daha sonra, bağlı lexA kromatin komplekslerini çıkarmak için boncuklara 500 mikrolitre 0.5 molar amonyum hidroksit ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Manyetik bir raf kullanarak boncukları süspansiyondan ayırın ve elüatı düşük bağlayıcı bir reaksiyon tüpüne aktarın.
Düşük bağlanma reaksiyon tüpünü oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve manyetik bir raf kullanarak boncukları süspansiyondan ayırın. Tamamlandığında, elüatı düşük bağlayıcı bir reaksiyon tüpüne aktarın. Boncukları 750 mikrolitre deiyonize suda tekrar süspanse edin ve DNA ve protein analizi için örnekler toplayın.
Son olarak, son elüattan DNA ve protein analiz örnekleri alın. Çalışmada, ARS316 lokusunun ve rekombinasyon suşunun saflaştırma etkinliği ölçüldü ve kontrol lokusu PDC1 ile karşılaştırıldı. ARS316 lokusu, PDC1'e kıyasla akışta daha düşük iyileşme gösterdi.
Kromatin halkalarının bir kısmı, eksik TEV proteaz bölünmesi nedeniyle TEV boncuklarına bağlı kalmasına rağmen, denatürasyon elüsyonu% 80 ila% 90 ARS316 lokusu geri kazanımı ile sonuçlandı. Bu, niceliksel fraksiyonların hiçbirinde ARS316 lokusunun zenginleşmesini göstermeyen kontrol suşuna kıyasla, maya genomunun boyutunu hesaba katarken, TEV boncuklarında ve denatürasyon elüsyon fraksiyonlarında ARS316 moleküllerinin yüksek zenginleşmesine karşılık gelir. TEV elüsyonundan sonra, TEV bölünme verimliliği %100 olmadığı için boncuklar ARS316 lokusunun daha yüksek bir geri kazanım yüzdesini gösterdiBu, kromatin halkalarının bir kısmının boncuklara bağlı kalmasına neden oldu.
Bununla birlikte, denatüre edici elüs, ARS316 lokusunun %80 ila 90 oranında geri kazanıldığını ve maya genomunun boyutunu hesaba katarken ARS316 moleküllerinin yüksek zenginleşmesine karşılık gelen rekombinasyon suşunu gösterdi.
