Başlamak için, ötenazi uygulanmış fare yavrularından izole edilen beyni alın ve EBSS ve 2X PSN ile soğuk MEM içeren üç santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Bir diseksiyon kapsamı altında, beyin yarım kürelerini ayırın, orta beyni, hipokampusu ve meninksleri çıkarın ve atın. Her iki kortikal yarım küreyi 2X PSN'li beş mililitre MEM EBSS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve buz üzerinde tutun.
Bir doku kültürü davlumbazında, bir pipet kullanarak ortamı 50 mililitrelik konik tüpten aspire edin ve kortikal doku parçalarını altta bırakın. Kaplanmış bir cam pipet ile 10 mililitre önceden ısıtılmış ayrışma ortamı ekleyin ve dokuyu 10 ila 20 kez ezin. Süspansiyonu küçük bir karıştırma çubuğu içeren 50 mililitrelik bir behere aktarın ve bir karıştırma plakasına yerleştirin.
Daha sonra kabı çıkarın, dokunun yerleşmesine izin vermek için üç dakika boyunca 30 derecelik bir açıyla ayarlayın ve hücre süspansiyonunu buz üzerinde 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın. 50 mililitrelik konik tüpü 1000G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı glial büyüme ortamı ile değiştirin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
Hücreleri 10 santimetrelik hücre kültürü ile muamele edilmiş kaplarda bir milyon yoğunlukta kaplayın ve 24 saat inkübe edin. Daha sonra ortamı taze glial ortamla değiştirin ve deney için kaplamadan önce hücrelerin iki hafta içinde %100 birleşmesine izin verin. Altı oyuklu plakalarda kuyu başına 100.000 glial hücre plakalayın ve in vitro prion enfeksiyonu için% 80 ila% 100 birleşmeye ulaşmalarına izin verin.
% 20 seyreltilmiş beyin homojenatlarını ve PBS'yi 30 dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın. Enfekte olacak Glia'dan ortamı aspire edin ve kuyucuk başına% 0.1 normal veya prion beyin homojenatı ile 1.5 ila 2 mililitre glial büyüme ortamı ekleyin. 72 saat sonra, ortamı çıkarın, hücreleri PBS ile yıkayın ve taze glial büyüme ortamı ekleyin.
Serolojik bir pipet kullanarak% 0.25 tripsin çözeltisi içinde yaklaşık bir mililitre HBSS'de yağ dokusunu dikkatlice aspire edin. Dokuyu Dnase-1, kollajenaz ve Dispase karışımı ile iki mililitre DMEM F-12 ortamı içeren dört santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Daha sonra yağ dokusunu makas kullanarak küçük parçalar halinde kesin ve karışımı 37 santigrat derecede 1.5 saat inkübe edin.
Dokuyu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, dokuyu tritüre edin ve kırmızı görünecek olan stromal vasküler fraksiyonu peletleyin. Peletleri steril PBS ile yıkadıktan ve üç dakika santrifüjledikten sonra, peleti bir mililitre ADMSC ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, ayrışmamış dokuyu çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir süzgeçten steril 50 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin.
10 santimetrelik hücre kültürü ile muamele edilmiş bir tabağa dokuz mililitre ADMSC ortamı ekleyin. Süzülmüş hücre süspansiyonunu içine pipetleyin ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Ertesi gün ortamı değiştirin ve hücreler %80 ila %90 birleşim noktasına ulaştıklarında hücrelerden geçirin.
Hücreler iki ila üç geçişten geçtikten sonra, bunları üç ila 10 mililitre ortamda yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak sayın. ADMSC ortamı içeren altı oyuklu plakalarda kuyu başına 100.000 hücre plakalayın ve daha önce gösterildiği gibi gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, mililitre TNF-alfa başına 10 nanogram veya mililitre IFN-gama başına 200 nanogram ile sitokin ile uyarılan hücreler için ADMSC ortamını hazırlayın.
Kontrol numuneleri için %0.1 prion ile enfekte olmuş veya normal beyin homojenatı nihai konsantrasyonuna sahip ADMSC ortamı oluşturun. Eski ortamı aspire edin, 1.5 mililitre sitokin veya beyin homojenat içeren ortamı üç kopya halinde karşılık gelen oyuklara ekleyin ve plakaları inkübatöre geri koyun. Daha sonra hücreleri PBS ile yıkayın ve her oyuğa% 1 beta-merkaptoetanol ile 350 mikrolitre lizis tamponu ekleyerek RNA'yı izole edin.
Bir hücre kaldırıcı kullanarak hücre lizatlarını çıkarın ve numune başına 25 nanogram RNA'yı ters yazıya dökün ve tamamlayıcı DNA'yı çoğaltın. Plaka BV2 mikroglia, kuyu başına 50.000 hücre veya altı oyuklu bir plakada kuyu başına 100.000 hücrede birincil karışık glia. BV2 hücrelerini% 0.1 prion enfekte veya normal beyin homojenatı içeren ortamlarla tedavi edin ve 72 saat inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, kalan beyin homojenatını çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Hücrelere taze ortam ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun. ADMC'leri uyarmak için, BV2 veya karışık glia ile birlikte kültürlemeden önce 24 saat boyunca mililitre başına 10 nanogram TNF-alfa ile muamele edin.
Uyarılmış ADMC'leri PBS ile üç kez yıkayın ve ADMSC süspansiyonunu daha önce gösterildiği gibi döndürün. BV2 hücreleri veya karışık glia üzerindeki ortamı, ADMSC ortamının oyuğu başına iki mililitre ile değiştirin ve oyukların yarısına 0,4 mikrometre gözenek boyutuna sahip altı oyuklu plakalar için ekler yerleştirin. Her bir kesici parçaya iki mililitre ADMSC ortamı ekleyin ve ek almayan kuyucuklara iki mililitre daha ek ortam ekleyin.
Peletleme işleminden sonra, ADMC'leri yeniden askıya alın ve sayın, her bir parçaya 50.000 ila 100.000 hücre ekleyin ve inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, ekleri çıkarın ve atın veya bunları yeni bir altı oyuklu plakaya yerleştirin ve ekleri PBS ile iki kez yıkayın. RNA izolasyon kiti tarafından sağlanan tamponu karışık glia veya BV2 hücrelerine ekleyin ve kuyuları kazıyın.
