Plakayı EME ile kaplamak için, EME 1 ila 20'yi soğukta seyreltin Gelişmiş DMEM+ Kollajen ile kaplama için, Gelişmiş DMEM+'da mililitre başına beş miligram kolajen I'i mililitre başına 100 mikrograma seyreltin. Kuyu yüzeyini tamamen kaplamak için plakayı 200 mikrolitre seyreltilmiş EME veya kollajen ile kaplayın ve 37 santigrat derecede bir ila iki saat inkübe edin. Tek katmanlar oluşturmak için, ortamı organoidler içeren 35 milimetrelik bir plakadan aspire edin.
Bir mililitre PBS ekleyin ve tüm EME'yi gevşetmek için yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek bir P1000 ucuyla kuyucuklardaki EME'yi bozun. İçeriği 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ek organoidleri toplamak ve bunları aynı konik tüpe aktarmak için plakaya bir mililitre PBS ekleyin.
Numuneyi 350 G'de iki dakika santrifüjleyin ve herhangi bir EME kalıntısı da dahil olmak üzere süpernatanı çıkarın. Ardından, organoid peletine bir mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. Bir P1000 ucu kullanarak 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve tripsini nötralize etmek için iki mililitre Gelişmiş DMEM+ ekleyin.
Beş dakika boyunca 350 G'de santrifüjleyin ve peleti 4.8 mililitre rIOM2D içinde yeniden süspanse etmeden önce süpernantı aspire edin. Advanced DMEM+'daki fazla EME veya kollajeni kuyulardan çıkarın. Ardından, önceden kaplanmış her bir kuyucuğa rIOM2D'de 200 mikrolitre organoid ve 10 mikromolar Y27632 ekleyin.
4 ila 16 saat sonra, ortamı toplayın ve bir dakika boyunca 1.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve peleti atın. Her kuyucuğa 200 mikrolitre santrifüjlenmiş rIOM2D eklemeden önce her bir kuyuyu 300 mikrolitre PBS ile yıkayın.
rIOM2D'yi her iki ila üç günde bir değiştirin, EME üzerine kaplanmış Y27632.2D tek katmanlarının kullanımını askıya alın, EME hücrelerin tepesine geri eklendiğinde kolayca küçük sferoidlere dönüştürülür. Buna karşılık, bir kollajen I substratı, 3D yapıları yeniden oluşturmak için yetersizdi.
