Gözü yuvadan çıkarmak için göz çevresindeki dokuya bastırmak için kavisli forseps kullanarak göz enükleasyonu için ötenazi faresi konumlandırarak başlayın. Ardından gözü kaldırıp çıkarın ve diseksiyon tepsisindeki taze PBS'ye aktarın. Ultra ince makas kullanarak, optik siniri göz küresine mümkün olduğunca yakın kesin ve ince uçlu düz cımbızları gözün arkasındaki optik sinirin çıkışından göz küresine dikkatlice yerleştirin.
Şimdi, gözün arkasına makas yerleştirin ve posteriordan kornea skleral bileşkesine doğru bir kesi yapmaya başlayın ve kavşağın yarısı ayrılana kadar insizyona devam edin. Lensin kesiden çıkabilmesi için korneayı hafifçe itin. İnce uçlu düz cımbız kullanarak, lensteki büyük doku parçalarını dikkatlice çıkarın.
Ekvator bölgesini bulduktan sonra, lensi sığ bir şekilde delin ve ardından lens kapsülünü çıkarın. Lens fiber hücrelerini %1 paraformaldehit içeren 60 milimetrelik bir kaba aktarın. Keskin bir neşter kullanarak, lif hücrelerinin topunu ön arka ekseni boyunca ikiye bölün.
Ve sonra çeyrek üretmek için aynı eksen boyunca yarımları daha da kesin. Çekirdek bölgesini lens fiber hücre çeyreğinden çıkarmak için düz cımbız kullanın. Daha sonra, 48 oyuklu bir plakaya 200 mikrolitre% 1 paraformaldehit ekleyin.
Lens korteksini plakaya aktarın ve 300 RPM'de hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bloklamadan sonra, 48 oyuklu plakaya uygun birincil antikorlar ekleyin ve örnekleri birincil antikor çözeltisine aktarın. Numuneleri gece boyunca 4 santigrat derecede hafifçe çalkalama veya mutasyon ile inkübe edin.
Ertesi gün, numuneleri PTX ile yıkayın ve benzer şekilde ikincil antikorlarla inkübe edin. Numuneleri yıkadıktan sonra, artı şarjlı bir mikroskop lamına bir damla veya 50 mikrolitre montaj ortamı ekleyin. Dokuyu montaj ortamına yerleştirin.
Ve lif hücrelerini birbirinden nazikçe ayırmak için cımbız kullanın. Ardından, ayrılan hücrelerin ve montaj ortamının üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin. Fazla ortamı çıkardıktan sonra, konfokal mikroskopiden önce slayt üzerindeki kapak kaymasının kenarlarını kapatmak için oje kullanın.
Lens diseksiyonu ve lens kapsülü çıkarıldıktan sonra, fiber hücre kütlesini ıslak eldivenli parmak uçlarına aktarın ve lens çekirdeğini ayırmak için yavaşça her yöne yuvarlayın. Daha sonra, lens çekirdeğini 48 oyuklu bir plaka içinde yeni yapılmış% 1 paraformaldehit çözeltisine aktarın ve hafif çalkalama veya mutasyon ile gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi %1 paraformaldehit içeren 60 milimetrelik bir tabağa aktarın ve lens çekirdeğini ön arka eksen boyunca ikiye, ardından dörde bölmek için keskin bir neşter kullanın.
Ardından, numuneyi daha önce gösterildiği gibi postfix, blok, boyayın ve monte edin Bu preparatlarda, farklı lens bölgelerinden benzersiz morfolojilere sahip lens fiber hücre demetleri bulunur. F-aktin ağının boyanması, farklılaşan ve olgun liflerde hücre zarında zenginleşme gösterirken, F-aktin sinyalleri nükleer liflerin sitoplazmasında bulunur. Taramalı elektron mikroskobu ve farklılaşan lif hücrelerinin konfokal görüntüleri, birbirine kenetlenen küçük çıkıntılara sahip top ve soket sayısallıklarını gösterirken, olgun lifler küçük çıkıntılarla süslenmiş küreklere sahiptir.
Taramalı elektron mikroskobu ve nükleer mercek lifi hücrelerinin konfokal mikroskop görüntüleri, hücre zarının pürüzlü olduğu hücrelerin kısa kenarlarında seyrek ve daha büyük birbirine kenetlenen çıkıntıları ortaya çıkarır ve bu hücrelerde merceğin merkezinden dil ve oluk arası sayısallıklar vardır.
