Başlamak için, yüksek çözünürlüklü respirometreyi açarak ekipmanı hazırlayın ve veri toplama ve analizi için respirometri yazılımı VatLab'a bağlayın. Oksigraf odasındaki %70 etanolü çift damıtılmış su ile değiştirin. Manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak, haznede 750 RPM'de sürekli karıştırın.
10 dakika bekletin ve ardından suyu aspire edin. Hazneyi her biri beş dakika boyunca çift damıtılmış suyla üç kez yıkayın. Oksijen sensörlerini kalibre etmek için önce çift damıtılmış suyu çıkarın ve iki mililitre hücre hazırlama ortamını hazneye pipetleyin.
Tıpaları bir hava değişim kabarcığı bırakarak yerleştirin. Oksijen kalibrasyon değerlerini kaydetmek için sensör kazancı, polarizasyon voltajı ve veri kayıt aralığı gibi ayarları yapın. Ardından denemeyi etiketleyin ve ortama girin.
Düzene tıklayın ve 01 Kalibrasyon Deneyi GR3 Sıcaklığı'nı seçin. Ortamı karıştırma çubuğu ile 750 RPM'de 30 santigrat derecede en az 37 dakika karıştırın ve sensör membranının performansını izleyin. Sol fare düğmesini ve Shift tuşunu basılı tutarak, oksijen konsantrasyonundaki değişimin sabit olduğu bir alan seçmek için fareyi sürükleyin.
Ardından oksigrafa ve ardından O2 Kalibrasyonu'na tıklayın. Hava kalibrasyonunda, seçilen işareti daha önce seçilen bölgeye değiştirin. Ardından kalibre et'e tıklayın ve panoya kopyalayın.
Kaydı durdurun ve oksigrafa tıklayarak kaydedin. Ardından Tamam Kontrolü ve ardından kaydedin ve bağlantıyı kesin. Daha sonra, solunum değerlendirmesi yapmak için odayı açın ve içindeki ortamı aspire edin.
Geçirgen hücre analizi için sperm hücrelerini iki mililitre MRM'nin son hacmine yükleyin. Alt köşedeki POS kalibrasyon kutusuna çift tıklayarak ve daha önce yapılan kalibrasyonu açarak kalibrasyonu yükleyin. Ardından denemeyi durdurun.
4.5 mikrolitre 10 milimolar digitonin enjekte edin ve hücreleri beş dakika boyunca geçirgenleştirin. Stabil bir sinyal elde edilene kadar sağlam hücrelerin solunumunu en az beş dakika kaydedin. Ardından kompleks I veya kompleks II için substratları ekleyin.Sinyal artana ve stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün.
Ardından, beş mikrolitre 0,5 molar ADP enjekte edin ve sinyal artıp stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün. Bir ATP sentetaz inhibitörü olan mililitre başına dört miligramlık bir mikrolitre Oligomisin ekleyin. Sinyal azalana ve stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün.
Maksimum bağlanmamış solunum hızına ulaşılana kadar 0,1 milimolar'dan bir milimolar'a kadar ardışık adımlarla bir mikrolitre FCCP ekleyerek titre edin. Sinyal artana ve stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün. Oksijen tüketimi azalmaya başladığında ilacı enjekte etmeyi bırakın.
Son olarak, mitokondriyal ve artık oksijen tüketimi arasında ayrım yapmak için kompleks I için bir mikrolitre bir milimolar rotenon veya kompleks II için beş milimolar Antimisin A enjekte edin. Sinyal azalana ve stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün. Veri analizi yapmak için, bir substrat veya inhibitörün enjeksiyonundan sonra ilişkili hacim başına oksijen akışının sabit olduğu bölgeleri seçin, işaretlere, ardından istatistik pencerelerine tıklayın ve verileri dışa aktarın.
1 milyon sperm hücresi başına elde edilen verileri normalleştirin ve mitokondriyal olmayan oksijen tüketimini tüm değerlerden çıkarın. Bu denklemleri kullanarak endeksleri hesaplayın. Mavi çizginin oksijen konsantrasyonunu gösterdiği ve kırmızı çizginin ilişkili hacim başına oksijen akışını temsil ettiği bir semen örneğinden bozulmamış sperm hücrelerinin başarılı bir şekilde kaydedilmesi sağlandı.
Daha düşük sperm hücresi sayıları, daha düşük başlangıç oksijen tüketimi ile sonuçlandı. Ayrıca, bu protokol kullanılarak özellikle mitokondriyal kompleks I veya kompleks II için oksijen tüketim eğrileri elde edildi.
