Başlamak için, kurban edilen 10 haftalık C57 siyah 6J erkek fareye %70 etanol iyice püskürtün. Forseps kullanarak cildi arka bacaktan çıkarın ve femur, tibia ve fibulayı çevreleyen tüm uzuv kaslarını inceleyin. Hasat edilen uzuv kaslarını, bir mililitre kas izolasyon tamponu içeren iki mililitrelik bir tüpe yerleştirin.
Ve makas kullanarak, hasat edilen kasları kıyın. Kıyılmış kas süspansiyonunu 18 mililitre kas izolasyon tamponu içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü sıkıca kapatın, laboratuvar filmi ile kapatın ve çalkalanan bir su banyosuna yatay olarak yerleştirin.
30 dakika sonra, beş miligram tip I kollajenaz ekleyin ve tüpü 30 dakika daha koruyun. Kas süspansiyonunu 10 kez yukarı ve aşağı pipetledikten sonra, süpernatanı santrifüjleyin ve atın, tüpte beş mililitre ortam bırakın. Süspansiyonu ardışık hücre süzgeçlerine pipetleyin ve akışı 50 mililitrelik tüpe toplayın.
Süspansiyonu santrifüjleyin ve tüpte sadece 100 ila 200 mikrolitre kalana kadar süpernatanı atın. Peletleri iki mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve üç dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Tekrar santrifüjleyin ve 20 ila 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak süpernatanı tüpten çıkarın.
Peletleri 100 mikrolitre soğuk FACS tamponunda tekrar süspanse edin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Negatif kontrol için 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu çıkardıktan sonra, kalan 90 mikrolitreyi santrifüjleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca serumsuz DMEM içinde seyreltilmiş 400 mikrolitre sabitlenebilir canlılık lekesi ile inkübe etmeden önce süpernatanı atın. Santrifüjlemeden sonra, 100 mikrolitre FACS tamponu ekleyin ve tüpü üç kez hafifçe ters çevirin.
Tekrar santrifüjleyin ve tüpe 100 mikrolitre primer antikor karışımı ekleyin. Karanlıkta 30 dakika inkübasyondan sonra, süpernatanı santrifüjleyin ve atın. Sonra hücreleri yıkamak için 500 mikrolitre PBS ekleyin.
Tekrar santrifüjleyin ve peleti 500 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı çıkarın. Süspansiyonu beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir akış sitometresinde işlemeden önce hücre süspansiyonunu kısaca vorteksleyin.
Seçilen hücreleri, FACS tamponu içeren beş mililitre kaplı tüpte toplayın. Boyutlarına ve tanecikliliklerine göre tanımlanan tek çekirdekli hücrelerin %75'i, canlı hücrelerin ortalama %34.3'üne yol açan sabitlenebilir canlılık leke işaretleyicisi için negatifti. Tek canlı hücrelerin yaklaşık% 3'ü monosit, endotelyal, lökosit ve eritroid spesifik belirteçler için negatifti.
Bu negatif hücreler daha sonra CD34 ve ITGA7 belirteçlerinin ekspresyonlarına göre seçildi. Varsayılan uydu hücrelerini seçmek için CXCR4 için son bir geçit yapıldı. CD34 pozitif ITGA7 pozitif hücrelerin %80'inin CXCR4 pozitif olduğu bulundu.
