Bir bunsen brülörü kullanarak üç mera pipetini ateşte parlatarak başlayın ve azalan çaplar oluşturun. Daha sonra, ötenazi yapılmış bir hamile fare barajının karnını% 70 etanol ile sterilize edin. Karın boşluğunu kasık sentezinden göğüs kafesinin ksifoid sürecine kadar kesin.
Şimdi, uterus boynuzunu karın boşluğundan çıkarın ve buz gibi soğuk HBSS çözeltisi ile doldurulmuş 100 milimetrelik bir plakaya yerleştirin. İnce forseps kullanarak yıkanmış uterustaki tüm embriyoları çıkarın ve ayırın. Ekstrakte edilen fare embriyolarının başını hızla ayırın ve kafaları HBSS ile doldurulmuş 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.
Beyni tutmak için göz boşluğuna bir çift ince forseps yerleştirin. Başka bir çiftle, beyin görünene kadar cildi ve kafatasını soyun. Beyni kafatasındaki koku ampullerinden çıkarın ve baş aşağı çevirin.
Ventral taraftaki korteksi ve dorsal taraftaki hipotalamusu gözlemleyin. Beyin beyaz ve berrak görünene kadar meninksler ve kan damarları tabakasını çıkarmak için kavisli forseps kullanın ve hipotalamik alanı beynin geri kalanından ayırın. Hipotalamusu üç ila dört küçük ince parçaya bölün ve parçaları 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir pipet kullanın.
Ardından, tüpü altı mililitre HBSS ile doldurun. Ardından, doku yerleştikten ve süpernatan çıkarıldıktan sonra Enzim Karışımı 1'i ekleyin. Tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin ve dokuyu yeniden askıya almak için her beş dakikada bir çalkalayın.
Şimdi, 30 mikrolitre Enzim Karışımı 2 ekleyin ve büyük çaplı bir mera pipeti ile 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu ayırın. 10 dakikalık ek bir inkübasyondan sonra, kalan 15 mikrolitre Enzyme Mix 2'yi ekleyin. Çapı küçülen iki ateşle parlatılmış pipet kullanarak, dokuyu 10 kez pipetleyin.
Hemen% 0.5 BSA ile 10 mililitre HBSS tüpüne ekleyin. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve% 0.5 BSA ile bir mililitre HBSS'de hücre peletini yeniden süspanse edin.
