Başlamak için, hazırlanan maya alt mitokondriyal veziküllerini alın ve üretilen vezikülleri santrifüjleyin ve kalan bozulmamış mitokondriyi dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 20.000 G'de santrifüjleyin. Sağlam mitokondri, veziküller süpernatantta kalırken peleti oluşturdu. Ardından, süpernatanı taze ultra santrifüj tüplerine aktarın.
Bir kanül ile donatılmış bir mililitrelik şırınga kullanarak tüpün dibine 0.3 mililitre 2.5 molar sükroz çözeltisinden oluşan bir yastık yükleyin ve dört santigrat derecede 100 dakika boyunca 118.000 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, veziküller sükroz yastığının üstünde bir disk olarak görünecektir. Süpernatantın yaklaşık% 90'ını atın.
Konsantre vezikülleri hasat etmek için, pipetleme yoluyla 2,5 molar sükroz da dahil olmak üzere kalan tamponda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu buz gibi bir Dounce homojenizatöre aktarın ve süspansiyonu en az 10 stroklu bir politetrafloroetilen çömlekçi kullanarak homojenize edin. Daha sonra, her katman 2.2 mililitre sükroz çözeltisi içeren 11 mililitrelik bir adım gradyanı hazırlayın.
Bu formülü kullanarak sükroz konsantrasyonunu hesaplayın. Santrifüj tüpüne en yüksek sakaroz konsantrasyonunu ekleyin ve katman tamamen donana kadar eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin. Bir refraktometre kullanarak numunelerin sakaroz konsantrasyonunu ölçün.
Bir refraktometre mevcut değilse, sükroz konsantrasyonunun 2 molar olduğunu varsayın. Sükroz konsantrasyonunu 0.6 azı dişine ayarlamak için, pH 7.4'te uygun MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F ve proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. Gradyanın bozulmasını önlemek için numuneleri dikkatlice sükroz gradyanına yükleyin.
Vezikülleri 12 saat boyunca 200.000 G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Mümkünse, eğimin bozulmasını önlemek için yavaş hızlanma ve yavaşlama ayarlayın. Ardından, bir mililitrelik bir pipet kullanarak gradyanı yukarıdan aşağıya 700 mikrolitrelik fraksiyonlar halinde hasat edin.
Yeterli bir çözünürlük sağlayan 17 kesir ile sonuçlanır. Daha sonra, tek tek fraksiyonlara 200 mikrolitre% 72 trikloroasetik asit ekleyerek ve çözelti homojen olana kadar karıştırarak ardışık olarak yürütülen iki trikloroasetik asit çökeltmesi gerçekleştirin. Fraksiyonları buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve çökeltilmiş proteinleri 20, 000 G ve dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyerek peletleyin.
Süpernatanı atın. 500 mikrolitre% 28 trikloroasetik asit çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve santrifüj adımını tekrarlayın.
Son olarak, fraksiyonları SDS-PAGE ve immünoblotlama ile analiz edin. Hafif sonikasyonun önemi burada sunulmaktadır. Mitokondriyal dış zar belirteci Tom40, erken düşük yoğunluklu fraksiyonlarda zenginleştirildi ve daha sonrakilerde neredeyse yoktu.
Mitokondriyal iç zar markörü Tim17, yüksek yoğunluklu fraksiyonlarda konsantre edildi. Buna karşılık, temas bölgesi proteini Mic60, çeşitli zar veziküllerinin başarılı bir şekilde üretildiğini ve ardından ayrıldığını gösteren ara sükroz konsantrasyonunun ihlallerini biriktirdi. Buna karşılık, daha sert sonikasyon koşullarıyla, mitokondriyal dış zar işaretleyicisi Tom40, gradyanın daha düşük fraksiyonlarında tespit edilebilir.
Ek olarak, önemli miktarda orta yoğunlukta Tim17 ihlali vardı.
