Tek bir bakteri kolonisini 500 mililitrelik bir Erlenmeyer şişesinde 200 mililitre sterilize edilmiş Luria suyuna aşılayarak başlayın. Bakterileri gece boyunca 37 dereceye ayarlanmış bir çalkalayıcı inkübatörde kültürleyin. 14 saatlik kültürden sonra, bakterilerin optik yoğunluğunu 600 nanometrede kontrol edin.
Bakterileri 50 mililitrelik konik tüplere koyun ve daha sonra kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın. Serolojik bir pipet kullanarak, 50 mililitre bakteri kültürünü yeni bir 250 mililitrelik Erlenmeyer şişesine aktarın Canlı veya sahte işlem görmüş kontrol için tüpleri etiketleyin. Yıkamadan önce sahte işlem görmüş kontrol için 50 mililitre bakteriyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.
Kimyasal davlumbazda, %0,5'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için bakteri kültürüne 781 mikrolitre paraformaldehit ekleyinKullanılmış ucu katı atık kimyasal tehlike kabına atın. Daha sonra, şişeyi bir folyo tabakasıyla örtün ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, kalan paraformaldehiti çıkarmak için bakterileri yıkayın.
Kalıntı paraformaldehitin çıkarılması için, serolojik bir pipet kullanarak, muamele edilen bakterileri Erlenmeyer şişesinden 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, tedavi edilen bakterileri 20 dakika boyunca yaklaşık 3000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı, kimyasal davlumbazın içindeki bir sıvı atık kimyasal tehlike kabına atın.
Şimdi işlenmiş ve kontrol edilen bakteri peletlerine 25 mililitre Luria suyu ekleyin ve bakteri peletlerini yeniden süspanse etmek için girdap yapın. Santrifüjleme ve pelet yeniden süspansiyonunu dört kez tekrarlayın. Çeşitli tahlillere hazırlanırken, peleti uygun hacimlerde yeniden süspanse edin.
Ömür taylileri için. 10 mililitre Luria suyunda 60 milimetrelik plakalara yeniden süspanse edilen 200 mikrolitre bakteri tohumu. Bakterileri dört santigrat derecede saklayın.
Bakteri üremesinin kalite kontrolünü yapmak için, steril bir pipet ucu kullanarak hazırlanmış bir bakteri içeren bir Luria et suyu tabağı çizin. Kontaminasyonu doğrulamak için, yıkamak ve yeniden süspanse etmek için kullanılan Luria suyunu ayrı bir tabakta bifteğin. Daha sonra plakaları gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.
Ertesi gün, herhangi bir bakteri üremesi olup olmadığını kontrol edin. Paraform aldehit preparatı başarılı olursa ve koloniler LB plakasında büyüyemezse bakterileri kurtarın. Bakteriyel metabolik aktiviteyi bir respirometre ile kontrol etmek için, önce 96 oyuklu bir plaka üzerindeki tüm kuyucuklara 200 mikrolitre kalibrant ekleyerek kartuşu nemlendirin.
Kartuşu 96 oyuklu plakaya yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Makineyi karıştırmak, ağırlıklandırmak, ölçmek ve döngüye almak için ayarlayın. Ertesi gün, hidratlı kartuşu makineye yerleştirin.
Yeni bir 96 oyuklu plakaya, test kuyucuklarına 160 mikrolitre M9, ardından 40 mikrolitre hazırlanmış bakteri ekleyin. Boşluk görevi görmesi için dört köşe kuyucuğuna 200 mikrolitre M9 ekleyin. Negatif kontroller olarak 160 mikrolitre M9 ve 40 mikrolitre Luria suyu dağıtın.
Son olarak, kalan kullanılmayan kuyucuklara 200 mikrolitre M9 pipetleyin. Ardından, programı çalıştırmadan önce çıkarılan kalibrasyon plakasını tahlil plakasıyla değiştirin. Sonuçlar oksijen tüketim oranı olarak görüntülenecektir.
Farklı suşlar, paraformaldehite farklı inaktivasyon yanıt süreleri sergiledi. Örneğin, HB101 bakterisinin bir saat boyunca% 0.25'e maruz kalması, metabolik olarak inaktif hale getirmek için yeterlidir. Enterococcus faecalis, tutarlı etki için% 1.0 konsantrasyon gerektirdi.
Caenorhabditis elegans solucanları, tedavi edilen OP 50 suşlarının yanı sıra sahte muamele edilen kontrole karşı benzer tercihler sergiledi. Bununla birlikte, hassas bir ikili tahlil, sahte muamele edilen kontrol için daha güçlü bir tercih ortaya çıkardı. Arıtılmış OP 50 üzerindeki solucanlar, sahte işlem görmüş kontroldeki solucanlardan daha yüksek bir pompalama hızına sahiptir.
Tedavi edilen bakterilerin tüketimi, yabani tip solucanlarda gelişme süresinin gecikmesine ve yumurtlama kapasitesinin düşmesine neden oldu. Solucanların ömrü, besin kaynağından bağımsız olarak birbirinden önemli ölçüde farklı değildi. Bununla birlikte, paraformaldehit ile muamele edilmiş bakteriler, 5-Floro-2'deoksiüridin varlığında solucan ömrünü uzatmıştır Paraformaldehit ile muamele edilmiş bakterilerin uzun ömürlü bir solucan suşu tarafından tüketilmesi, ömrünü değiştirmemiştir.
