Başlamak için, mitokondri hedefli HyPer7'yi eksprese eden bir orta log faz tomurcuklanan maya hücre kültüründen bir mililitre alın. Hücreleri 30 saniye boyunca 6.000 G'de santrifüjleyin ve tüpte 10 ila 20 mikrolitre bırakarak süpernatanı çıkarın. Hücre peletini bir mikro pipet kullanarak artık ortamla hafifçe karıştırarak yeniden süspanse edin.
Ardından, bir cam mikroskop lamını temizlemek için bir hava üfleyici veya tüy bırakmayan bir mendil kullanın ve slayta 1,8 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Son olarak, kabarcıkların girmesini önlemek için hücreleri belirli bir açıyla yavaşça indirerek 1.5 numaralı cam kapak kızağı ile örtün. Ardından slaydı mikroskop tablasına yerleştirin.
Hücreleri görüntülemek için, her floresan kanalında algılanabilir bir sinyal ve kabul edilebilir çözünürlük sağlamak için alım koşullarını ayarlayın. Örneğin, bir sCMOS kameralı dönen diskli konfokal mikroskopta 2x2 gruplama, %20 ila %40 lazer gücü ve 200 ila 600 milisaniye pozlama kullanın. Ardından, görüntü histogramını inceleyin.
12 bitlik bir görüntüde, piksel değerlerinin toplam dinamik aralığının doygunluk olmadan en az birkaç yüz gri seviye olduğundan emin olun. Ek olarak, aralığın gürültü seviyesinden bir kat daha yüksek olduğundan emin olun. Gürültü seviyesini hesaplamak için, görüntünün hücresiz bir alanındaki piksel değerlerinin standart sapmasını ölçün.
Ardından, görüntüleme koşullarının mitokondrideki sinyal kararlılığı ve oksidatif stres üzerindeki etkilerini değerlendirmek için alımlar arasında gecikme olmadan hızlandırılmış görüntüler toplayın. Mikroskop toplama yazılımını veya ImageJ'yi kullanarak, sinyal kararlılığını sağlamak için her bir floresan kanalındaki ortalama piksel değerini ölçün. Deney hızlandırılmış görüntüleme içermiyorsa, floresansın iki veya üç tekrarlanan Z yığını üzerinde sabit olduğundan emin olun.
Tomurcuklanan maya için toplam altı mikrometre yığın derinliğinde 0,5 mikrometre Z aralığına sahip görüntüler elde edin. Z yığınları topluyorsanız, Z aralığının veri kümesindeki tüm görüntüler için aynı olduğundan emin olun ve tüm hücreyi dahil edin. Ayrıca hücre sınırlarını belgelemek için iletilen ışık görüntülerini de alın.
