Başlamak için Fiji'de çok kanallı bir Z yığını görüntüsü açın ve istediğiniz biyosensör analizi komut dosyasını açın. Komut dosyasını çalıştırmak için komut dosyası düzenleyicisi penceresinde Çalıştır'ı tıklatın. Ardından, beliren diyalog penceresine istenen bilgileri girin.
Oran hesaplaması için pay ve paydanın kanal numaralarını seçin. Mitokondri hedefli HyPer7 için, pay 488 nanometrede uyarılmış kanaldır ve payda 405 nanometrede uyarılmış kanaldır. Varsa iletilen ışık görüntüsünün kanal numarasını veya yoksa sıfırı seçin.
Ardından istediğiniz arka plan çıkarma yöntemini seçin. Arka plan tekdüzeyse, görüntüdeki arka plan düzeyini ölçmek için bir görüntü alanı seç'i tıklatın. Ardından, dedektör okumasındaki rastgele değişimi azaltmak için istenen gürültü çıkarma yöntemini seçin.
Görsel alanı seç'i tıklayın. Önceden ölçülmüş bir gürültü seviyesini girmek için sabit değer seçeneğini seçin, bu genellikle görüntüleme koşulları sabit tutulursa iyi çalışır. Mitokondrinin doğru ve tutarlı tespiti için Otsu veya Maksimum Entropi gibi bir eşik algoritması seçin.
Bir deneydeki tüm görüntüler için aynı algoritmayı kullanın, ancak mitokondrinin doğru bir şekilde tanındığından emin olun. Ardından, hücre başına ilgilenilen bölge sayısını seçin. Örneğin, anne tomurcuk farklılıklarını ölçüyorsanız, iki tane seçin.
Ölçümlerin ve oran görüntülerinin kaydedileceği çıktı klasörünü seçin. Arka plan veya parazit düzeltme için Görüntü alanı seç'i seçin. Dikdörtgen ROI aracını kullanarak bir arka plan alanı çizmek için istemleri izleyin ve Tamam'a tıklayın.
Tek tek hücreleri veya hücre altı bölgeleri analiz ederken, parlak alan görüntüsüne dayalı olarak ilgi çekici bölgeler çizin. ROI'nin hücre taslağıyla tam olarak eşleşmesi gerekmez, çünkü ROI içindeki yalnızca eşikli mitokondri ölçülecektir. Her ROI'yi oluşturduktan sonra, seçilen ROI'yi ROI Manager'a eklemek için T tuşuna basın.
İşaretli hücreleri belgelemek için ROI Yöneticisi'nde Tümünü Göster'i işaretleyin. Eklenen her bölge, ROI Yöneticisi listesinde numaralandırılmış bir öğe olarak görünecektir. Hücre başına birden fazla ROI analiz ediyorsanız, analiz edilen her hücre için ROI'leri aynı sırada işaretleyin.
İstenen tüm ROI'ler ROI yöneticisine eklendikten sonra, Hücreleri İşaretle iletişim penceresinde Tamam'a tıklayın. Ardından, ölçüm tablosu formatını seçin. Çoklu Ölçü iletişim penceresinde, istenen formatta bir tablo oluşturmak için tüm dilimleri ölç ve dilim başına bir satır seçeneklerini işaretleyin.
Süreç çoklu ROI tablolarını kullanın. Dilim başına bir satır seçeneğiyle oluşturulan tabloları işlemek için rscript. Sonuçları ekle seçeneğini işaretlemeyin.
Komut dosyasını kullanarak çıktı dosyalarını seçilen klasöre kaydedin. Şimdi renklendirilmiş bir oran görüntüsü oluşturmak için Fiji'de oran Z yığını görüntüsünü açın. Ardından colorize_ratio_image açın.
ijm script dosyasını açın ve script editor penceresinde Çalıştır'ı tıklatın. İstenen bilgileri girmenizi isteyen bir diyalog penceresi görünecektir. Modüle edilmemiş seçenekte, tüm mitokondriyal pikseller aynı parlaklıkta görünür.
Loş ve parlak pikseller oran görüntüsüne katkıda bulunduğundan bazı görüntüler gürültülü görünebilir. Gürültüyü azaltmak için yoğunluk ayarlı seçeneği kullanın. Minimum ve maksimum görüntülenen değerler yönteminde, bir denemede gözlemlenen ortalama minimum ve maksimum değerlere yakın değerleri seçin.
Tutarlılığı sağlamak için, tüm görüntüleri aynı görüntüleme koşullarını kullanarak elde edin ve tüm görüntüleri aynı minimum ve maksimum değerleri kullanarak görüntüleyin. Ardından, Z yığınını yansıtmak ve renklendirmeden önce tüm mitokondriyal popülasyonu göstermek için projeksiyon modunu seçin. Maksimum yoğunluk projeksiyonu için maksimumu seçin.
Ortalama yoğunluk projeksiyonu oluşturmak için ortalama'yı seçin. Son olarak, renklendirilmiş görüntülerin kaydedileceği klasörü seçin. Modüle edilmemiş seçeneği seçiliyse, görüntülenen iletişim penceresinde bir renk şeması seçin.
Fiji'de yerleşik olarak bulunan ateş veya gökkuşağı RGB arama tablolarını veya ImageJ'nin LUT formatında istenen herhangi bir arama tablosunu kullanın. Çıktı dosyalarını seçili klasöre kaydetmek için komut dosyasını kullanın. HyPer7 etiketli mitokondrinin oksitlenmiş indirgenmiş oranı, hidrojen peroksit konsantrasyonuna doza bağlı bir yanıt gösterdi ve bu, bir ila iki milimolar harici olarak eklenen hidrojen peroksitte bir platoya ulaştı.
Maya hücrelerinde mitokondriyal hidrojen peroksitte farklılıklar gözlendi. Tomurcuktaki mitokondride ana hücreye kıyasla hidrojen peroksit biyosensör okumasında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma tespit edildi.
