Sıfır gününde, 15 santimetrelik bir tabakta %10 FBS içeren 30 mililitre antibiyotiksiz DMEM'de 10 milyon 293T hücre. Toplam 10 yemek hazırlayın. Ertesi gün, yani birinci gün, hücrelerin %80 oranında birleştiğini ve transfeksiyona hazır olduğunu onaylayın.
Daha sonra sırayla 50 mililitrelik bir konik tüpe, mikrolitre ambalaj plazmid karışımı ve 60 mikrolitre plazmit barkod kitaplığı başına 600 mikrolitre 0.5 mikrogram ekleyin. Ayrı bir 15 mililitrelik konik tüpte, 900 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ve 12 mililitre DMEM'i vorteksleme ile karıştırın. Bu karışımdan 12.9 mililitre DNA karışımına ekleyin ve birleştirmek için hafifçe vurun.
Daha fazla karıştırmadan, karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, 293T hücrelerini içeren her 15 santimetrelik kaba 2,5 mililitre inkübe edilmiş karışım ekleyin ve hücreleri gece boyunca bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. Üçüncü günde, ortamı 0,2 mikronluk bir filtrasyon ünitesinden geçirerek virüsü hasat edin.
Viral partiküller içeren süzüntüyü 15 mililitrelik konik tüplere ayırın. Ek olarak, viral titre için kriyo şişelerinde beş mililitrelik filtrelenmiş virüs alikutu hazırlayın. Lentiviral havuzları titrelemek için, 65 mililitre tümör hücresi büyüme ortamı içeren steril bir cam şişeye 65 mikrolitre Katyonik polimer ekleyin.
Polimer içeren ortamın bir mililitresini 11 altı oyuklu doku kültürü plakasına pipetleyin. Daha sonra erken geçiş tümör hücrelerini deneyin. Tercih edilen bir yöntemi kullanarak hücreleri saydıktan sonra, hücreleri altı oyuklu plakalara aktarın.
48 saatlik lentivirüsün bir mililitrelik alikotlarını dondurucudan 37 santigrat derecede bir su banyosunda çözdürün. Her viral modül için enfeksiyonu hazırlamak için tabloyu takip edin.
