Bir hücre süspansiyonu oluşturmak için insan mezenkimal kök hücrelerini tripsinizleştirerek başlayın. Daha sonra, 10 yapı oluşturmak için hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir tüpe ayırın. Süspansiyonu 220 g'da üç dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı çıkarmak için bir vakum pompası kullanın.
Şimdi, hücre peletini buzun üzerine yerleştirin. Ardından, tiyol ile modifiye edilmiş hyaluronik asit, tiyol reaktif çapraz bağlayıcı, polietilen glikol diakrilat ve gazı alınmış su şişelerini oda sıcaklığına getirin. Steril koşullar altında, hyaluronik asit içeren şişeye bir mililitre gazı alınmış su eklemek için iğneli bir şırınga kullanın.
Çözeltiyi girdaplayın, ara sıra berraklaşana kadar 37 santigrat dereceye ısıtın. Ardından çözeltiyi buzun üzerine yerleştirin. Steril koşullar altında, çapraz bağlayıcı şişesine 5 mililitre gazdan arındırılmış su ekleyin.
Buz üzerine koymadan önce tekrar tekrar ters çevirerek eritin. Şimdi, aliquoted hücre peletine 120 mikrolitre çözünmüş hyaluronik asit çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi ileri geri pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse hücre peleti ile tüpe 30 mikrolitre çözünmüş çapraz bağlayıcı çözeltisi ekleyin.
Tüpe dokunarak uygun şekilde karıştırıldığından emin olun. Karıştırdıktan sonra, çözeltiyi kısaca aşağı doğru döndürün. Kombine çözeltinin 15 mikrolitresini parafin kaplı 24 oyuklu bir plakaya bırakın.
30 dakika boyunca 37 santigrat derecede katılaşmasına izin verin. İn vitro farklılaşma için, hücreye oturan hidrojellere 0.5 mililitre kondrojenik farklılaşma ortamı ekleyin. Üç hafta sonra, kuyucuk başına 0,5 mililitre ekleyerek hipertrofik farklılaşma ortamına geçin.
Kondrojenik farklılaşma, hem hyaluronik asit hem de HA ve kollajen yapılarında tip 2 kollajen pozitif hücre dışı matrikste sülfatlanmış glikozaminoglikanlarla sonuçlandı. Bununla birlikte, hyaluronik asit yapılarında dağılım daha homojendi. Kollajen yapıları, heterojen morfolojiye sahip periferik hücreler gösterdi.
HA yapılarındaki hücrelerin ortalama yuvarlaklığı, kollajen yapılarından daha yüksekti. Kalsiyum birikimi her iki yapının dış kenarlarında beş haftada tespit edildi. In vivo HA yapılarında, tüm implantlar cilt altı ceplerde birbirine tutturulmuş ve entegre kemik dokusu oluşturmuştur.
İn vivo kollajen yapılarının %40'ı bağımsızdı. İmplantasyondan sekiz hafta sonra her iki in vivo yapının dış bölgelerinde lameller morfolojiye sahip osteoid doku oluştu. HA yapısında kıkırdak kaybı da gözlendi.
Çoklu in vivo HA yapılarının, kemik dokularına bağlantı ve eklem fibröz dokusunun varlığı ile gösterildiği gibi entegre kemik dokusu oluşturduğu görülmüştür. Kollajen yapılarının %40'ı birleşirken, geri kalan yapılar ayrıydı veya sadece kemik dokusu bağlantıları olmadan bağlanmıştı. Her iki yapı da kemik iliğinde pozitif olarak işaretlenmiş damarlar gösterdi ve iç kıkırdak çok çekirdekli osteoklast hücreleri ile çevriliydi.
Mineral, daha büyük boyutlarından dolayı daha yüksek mineral hacmine sahip yapıların ve HA yapılarının dış osteoid bölgesinde birikmiştir.
