IPSC Differentiation into Posterior Primitive Streak and Nephrogenic Intermediate Mesoderm

İndüklenmiş pluripotent kök hücreleri veya iPSC'leri membran matrisi kaplı 6 oyuklu plaka üzerinde iki mililitre DPBS ile yıkayarak başlayın. DPBS'yi bir pipet kullanarak aspire edin. Ardından, iPSC'leri ayırmak için piyasada bulunan hücre ayırma çözeltisinden bir mililitre ekleyin.

Ardından hücreyi beş dakika boyunca 37 derecede bir inkübatöre yerleştirin. Şimdi iPSC'lerin üzerine bir mililitre mTeSR pipetleyin ve hücrelerin plastik yüzeyden ayrıldığından emin olun. Bu hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 400 g'da santrifüjleyin.

Hücre peletini yeniden süspanse edin, ardından bir hemositometre kullanarak hücre sayılarını sayın. Daha sonra, bir membran matrisi ile kaplanmış 6 oyuklu bir plaka üzerinde bir dizi hücre yoğunluğu tohumlayın. Bunları 10 mikromolar Rho-kinaz inhibitörü ile desteklenmiş mTeSR ile kültürleyin.

Plakaları gece boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir karbondioksit inkübatörde kültürleyin. Ertesi gün mTeSR'yi aspire edin ve hücreleri iki mililitre DPBS ile yıkayın. Ardından, hücrelere iki mililitre aşama 1 ortamı ekleyin.

Ardından hücreleri dört gün boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Dördüncü günde, aşama 1 ortamını çıkarın ve hücreleri iki mililitre DPBS ile yıkayın. Ardından, hücreleri daha önce olduğu gibi inkübe etmeden önce hücrelere iki mililitre aşama 2 ortamı ekleyin.

Sıfırıncı günden dördüncü güne kadar, iPSC'ler hızla genişledi ve eşkenar dörtgen veya üçgen şekiller aldı. Birleşme %90 ila %100'e ulaştı ve yedinci güne kadar eşit olarak birikti. Süspansiyon kültürü üzerine, agregalar yedinci günde ayrıştıktan sonra kendiliğinden nefron yapıları oluşturur.