Başlamak için, her biri 12,5 x 7,5 santimetre ölçülerinde dört yaprak filtre kağıdı hazırlayın. İki sayfayı bir araya getirin ve yığını ıslatmak için transfer tamponuna yerleştirin. PVDF membranını %95 etanol içine yerleştirin ve membranı bir külbütör üzerinde bir dakika çalkalayın.
Etanolü hatırlayın. Membranı transfer tamponuna daldırın. Ve iki dakika çalkalayın.
Ardından, ıslatma filtre kağıdı yığınını büyük bir kapak gibi düz, hareketli bir yüzeye yerleştirin ve bir rulo kullanarak düzleştirin. Bir jel ayırıcı veya cımbız kullanarak, PVDF membranını yığının üzerine dikkatlice yerleştirin. Daha sonra, bu membranın üzerine tek bir yaprak kuru filtre kağıdı yerleştirin ve membranın yüzeyindeki fazla tamponu emmek için silindiri kağıdın üzerinde kaydırın.
Üst filtre kağıdını membrana sürtmeden kaldırın. Dondurucudan izole edilmiş lif numuneleri alın ve santrifüjlemeden ve numuneyi tamamen yeniden süspanse etmeden önce oda sıcaklığında çözdürün. Belirlenen membran alanının ortasına her numuneden bir mikrolitrelik bir damlacık yerleştirin.
Pipet ucuyla membrana dokunmaktan kaçının. Numune damlacıklarının 15 dakika boyunca membran tarafından tamamen emilmesine izin verin. Ardından bir jel ayırıcı veya cımbız kullanarak, membranı nemli filtre kağıdı yığınından dikkatlice kaldırın.
Kuru bir filtre kağıdına yerleştirin ve kuruması için en az beş dakika bekletin. Numune lekeleri tamamen beyaza döndükten sonra membranı yeniden etkinleştirin. Ardından hedef proteinin immüno-etiketleme işlemine devam edin.
Nokta leke görüntülerinden MHC izoformlarının ve Aktin sinyallerinin yoğunluğunu sınıflandırmak için sinyal paneli yoğunluğunu nasıl kullanacağınızı öğrenin. Güçlü, orta ve az hedef protein tespiti sırasıyla doymuş, orta ve zayıf sinyallerle gösterilir. Lif tipi tanımlaması için, başlangıçta miyozin ağır zincir IIA ve miyozin ağır zincir bir sonuçlarını karşılaştırın.
Doymuş veya orta sinyal yoğunluğuna sahip yalnızca tek bir miyozin ağır zincir izoformu gösteren lifleri belgeleyin. Aktin ile tespit edilen lifleri kaydedin ve miyozin ağır zincirli bir veya IIA'nın potansiyel tip 2X olarak tespit edilmemesini sağlayın. Orta derecede doymamış bir Aktin sinyali ile soluk bir miyozin ağır zincir izoform sinyali varsa, bunu tanımlanamayan olarak kaydedin.
Soluk veya tespit edilmemiş hedef proteinleri olan numuneleri atın. Hem MHCIIA hem de MHC1'in doymuş veya orta dereceli sinyallerini gösteren fiberler, fiber tipine özgü hazırlık için kullanılmamalıdır. MYO1D ID'den sonra, ilgili MHC izoformu için lifleri doymuş veya orta dereceli sinyallerle birleştirerek tip bir ve iki numune hazırlayın.
Her bir elyaf tipine özgü numuneden 10 mikrolitre kullanın ve bunları üreticinin yönergelerini izleyerek SDS sayfasına göre bir prekast jel üzerinde ayırın. Üreticinin protokolünü izleyerek hedef MHC izoformunu tespit etmek için bir jel görüntüleyici kullanın. Tüm fiber tipine özgü numunelerde her bir MHC izoformunun sinyal yoğunluğunu karşılaştırın.
Fiber tipi ID, orta veya doymuş sinyal yoğunluğunda doğru MHC izoformu ile doğrulanır. Nokta lekesinin immüno-etiketlemesi, tip iki fiberlerin, tip bir fiberlerin ve potansiyel tip 2X fiberlerin tanımlanmasına izin verdi. Lif tipine özgü numuneler, western blotting ve miyozin ağır zincir spesifik antikorlar kullanılarak doğrulandı.