Polarizasyona duyarlı iki fotonlu mikroskop sistemini oluşturduktan ve hizaladıktan sonra, görüntülenen şematik gösterime göre, optik hizalama kalitesini amorf bir polimerde bulunan floresein gibi izotropik bir referans numunesi ile test edin. Bunu yapmak için, uyarma lazerini açın ve sıfır yarım dalga plakası için referans numunenin 360 derecelik kutupsal grafiklerini ölçün. Yarım dalga plakası açısını, numune düzleminin X ve Y eksenlerine karşılık gelecek şekilde ayarlayın ve her iki fotodiyotun da iki foton uyarımlı emisyon bileşeninin benzer yoğunluklarını toplayıp toplamadığını kontrol edin.
Numuneyi analiz etmek için, cam slaytı bu küresel numuneyle birlikte Piezoelektrik S'ye monte edin.tage, kapak kaymasını içeren slaydın yüzünün yüksek sayısal açıklık daldırma hedefine baktığından emin olun. Ardından cam sürgüyü bantla sabitleyin. Ardından, mikroskop düğmelerini kullanarak X, Y ve Z konumlarını ayarlayarak, hedefi çözeltideki sferülit üzerinde odaklayın.
Küre çapları genellikle onlarca mikron aralığında olduğundan, özellikle tüm yapının merkezi alanına odaklanın. Sonra bu küreyi mikroskop düzlemindeki görüş alanında ortalayın. Tüm yapının alanını kapsayacak şekilde X ve Y yönlerindeki Piezo Stage adımlarının sayısını ayarlayarak XY taramasının boyutunu belirleyin.
Tarama hızı gibi Piezo Stage parametrelerini ayarlayın, adım boyutu, ve tüm sferülitin alanını kapsayacak şekilde aralık. Deklanşörü açın, fotodiyotları açın ve X ve ardından Y eksenlerine karşılık gelen polarize uyarma ışını için seçilen tarama alanının her bir adımı için iki foton uyarılmış floresan yoğunluğunun X ve Y emisyon bileşenlerini toplayın. Daha sonra bu sferülit örneğini tarayın, bu da iki foton uyarılmış floresan ile sonuçlanır.
Numune üzerindeki belirli noktadan tam polarizasyon analizi yapmak için, uyarma ışınını kapatın. Moleküllerin oryantasyonu hakkında bilgilerin mikron altı çözünürlükle gerekli olduğu bu küre üzerinde seçilen konuma karşılık gelen Piezo Stage'in belirli koordinatlarını alın. Piezoelektrik S'yi ayarlayıntage, görüş alanını belirtilen X ve Y koordinatlarında ortalayacak şekilde.
Uyarma ışınını açtıktan sonra, iki foton uyarılmış floresan emisyonunun X ve Y emisyon bileşenlerinin tam 180 derecelik polarizasyon analizini gerçekleştirmek için yarım dalga plakasının 360 derece dönüşünü açın. 2PFM raster taraması yapıldıktan sonra elde edilen insülin sferülitinin görüntüsü, bir sferülit için bildirilenlerle tutarlıydı. Numunenin X ve Y eksenleri boyunca uyarılmasına karşılık gelen yarım dalga plakasının konumu da doğrulandı.
Kutupsal grafikler, seçilen farklı noktalardan tam bir polarizasyon analizi yapılırken değişti. Küreselin dışında, FKÖ grafiği bir artefaktlar ve rastgele sinyal gürültüsü artışları koleksiyonuna benziyordu. X ve Y eksenleri boyunca çok düzenli konumlardan uygun şekilde ölçülen poligraflar, floroforların yerel oryantasyonuna ve organizasyonuna bağlı olarak farklı şekil ve geometrilere sahipti.
