Başlamak için, ötenazi fareye% 75 alkol püskürtün. Sonra cildi açmak ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için diseksiyon makasını sterilize ettiniz. Diyaframı kesin, ardından alt çeneye doğru yukarı doğru kesmeye devam edin ve karotis arteri açığa çıkaran fazla bağ dokularını ve yağı dikkatlice çıkarın.
Daha sonra, kapalı dolaşımdan kan akışını sağlamak için inferior vena kava'yı kesin. Bir şırınga kullanarak, sol ventriküle yavaşça 20 mililitre önceden soğutulmuş perfüzyon çözeltisi enjekte edin. Fareyi stereoskopik mikroskop altına yerleştirin.
Daha sonra mikro diseksiyon makası kullanarak karotis arter çevresindeki yağ ve bağ dokularını soyun. Karotis arteri izole edin ve kalan kanı temizlemek için PBS ile yıkayın. Arteri buz üzerinde% 1.5 FBS içeren altı oyuklu bir plakaya aktarın.
Mikro diseksiyon makası kullanarak, karotis arteri uzunlamasına inceleyin ve buz üzerinde bir mililitre FBS içeren altı oyuklu yeni bir plakaya düz bir şekilde yerleştirin. Kalan kanı çıkarmak için arterin intimasını FBS ile dikkatlice yıkayın. Arteri iki milimetre kare doku parçasına kesin ve bunları 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Dokuları dibe batırmak için 400 G'de 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve dokuları 500 mikrolitre ayrışma reaktifi içinde yeniden süspanse edin A.Tüpü bir saat boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin ve her 10 dakikada bir mililitrelik pipetle hafifçe pipetleyin. Daha sonra tüpe 500 mikrolitre% 5 FBS ekleyin ve iyice karıştırın.
Hücre süspansiyonunu steril bir 40 mikron hücre süzgecinden 1.5 mililitrelik bir tüpe süzün. Daha sonra süzüntüyü santrifüjleyin ve peleti 200 mikrolitre ayrışma reaktifi B.Hücreleri tek bir hücre süspansiyonuna tamamen ayırmak için tüpü bir su banyosuna yerleştirin. Beş dakika sonra, sindirim reaksiyonunu sonlandırmak için 200 mikrolitre% 5 FBS ekleyin, süspansiyonu santrifüjleyin ve peleti buz üzerinde 100 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı atın.
Mikroskobik gözlemler, ayrışma reaktifi B'nin reaktif A ile birleştirilmesinin, tek başına ayrışma reaktifi A'nın kullanılmasına kıyasla karotis arter dokusunun daha kapsamlı ayrışmasına yol açtığını gösterdi. Dokuz sol karotiden toplam 176.000 tek hücre toplandı ve çoğu vasküler damar başarılı bir şekilde yüksek canlılığa sahip tek hücrelere ayrıldı. Sindirimden sonra, denetimsiz SIRAH tabanlı kümeleme, normal fare karotis arterlerinde dört ana hücre tipini ortaya çıkardı.
