Akciğer dokusunu ve agarozu gömerek ve bir vibratom kullanarak bölümlere ayırarak başlayın. Dilimlenmiş dokulara 300 mikrolitre bloke edici madde ekleyin. Plakayı dört santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde 45 dakika boyunca hafif çalkalayarak inkübe edin.
Daha sonra, her bir oyuğa 300 mikrolitre PBS seyreltilmiş primer antikor pipetleyin. Plakayı gece boyunca dört santigrat derecede hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Şimdi dilime dokunmadan birincil antikorları nazikçe pipetleyin.
Dilimleri 400 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 300 mikrolitre seyreltik ikincil antikor pipetleyin. Soğuk inkübasyondan sonra antikor çözeltisini 90 dakika boyunca çıkarın.
Daha sonra DAPI ve domates lektin 488'i kuyucuklara ekleyin. Karışımı 30 dakika inkübe edin. DAPI ve domates lektinini çıkardıktan sonra, dilimleri PBS'de 10 dakikalık üç döngü boyunca yıkayın.
Bir fırça ile dilimleri bir slayta aktarın. Kızağa üç damla montaj ortamı yerleştirin ve görüntülemeden önce üzerine bir kapak kızağı monte edin. Fare, domuz ve insan örneklerinin akciğer bölümleri SMA, elastin ve LEA için immünofloresan olarak boyandı.
SMA ve elastin'in alveolar kanallar, kan damarları, bronşiyoller ve alveoller gibi yapılara dağıldığı gözlendi. Yetişkin ve bebek insanlarda tip II pnömosit dağılımının karşılaştırılması yapıldı. Tip II alveolar hücre antikoru HT2-280, pnömositlerin hücre yüzeyine güçlü bir afiniteye sahipti.
Bebek numunesi, önemli ölçüde daha yüksek bir tip II pnömosit sayısı verdi. Bununla birlikte, bebek numunesi ayrıca yetişkinlerden önemli ölçüde daha yüksek bir iskele kapsamı sergiledi. İskele kapsama alanına göre tip II pnömosit sayısı da bebeklerde anlamlı olarak daha yüksekti.
