VHL-MZ1 etkileşimleri için SPR gerçekleştirmek için, önce streptavidin çipini üreticinin talimatlarına göre etkinleştirin En yüksek konsantrasyonu elde etmek için,% 2'lik bir DMSO konsantrasyonu sağlamak için MZ1'e DMSO içermeyen bir tampon ekleyin. Şimdi 50 mikrolitre en yüksek konsantrasyonlu çözeltiyi 100 mikrolitre çalışan tampon içeren bir kuyuya pipetleyin. İkinci en yüksek konsantrasyonu ayarlamak için iyice karıştırın.
Ardından, 50 mikrolitre çözeltiyi sonraki 100 mikrolitre çalışma tamponuna aktarın, üçüncü en yüksek konsantrasyonu hazırlamak için iyice karıştırın ve bu şekilde devam edin. Plakayı kaplamak için polipropilen mikroplakalarla uyumlu kendinden yapışkanlı şeffaf plastik folyolar kullanın. Çok döngülü kurulumu kullanarak SPR'yi başlatın.
Modu yüksek performansa, temas süresini 120 saniyeye, ayrışma süresini 300 saniyeye ve akış hızını dakikada 50 mikrolitreye ayarlayın. Veri analizini yürütmek için cihaz üreticisi tarafından sağlanan değerlendirme yazılımını kullanın. VHL-MZ1-BRD4 üçlü kompleksi için SPR gerçekleştirmek için önce streptavidin'i etkinleştirin.
Yaklaşık 100 rezonans ünitesine hareketsiz hale getirmek için VHL solüsyonu enjekte edin. Sadece BRD4 kullanan negatif kontrol için, 200 mikrolitre hacimli çalışma tamponunda en yüksek konsantrasyon olan 25 mikromolar hazırlayın. Sonraki dört kuyucuğa, her biri iki mikromolar BRD4'ün 160 mikrolitresini ekleyin.
40 mikrolitreyi A5 kuyusundan A4'e aktarın. Ardından, iyice karıştırmak için kuyuyu pipetleyin. Benzer şekilde, 40 mikrolitreyi A4 kuyusundan A3'e aktarın ve bu işleme A1'e ulaşana kadar devam edin. MZ1 ve BRD4 ile üçlü kompleks oluşumu için, 196 mikrolitre 25.5 mikromolar BRD4 solüsyonu pipetleyin. Buna,% 100 DMSO çözeltisinde hazırlanmış dört mikrolitre 20 mikromolar MZ1 ekleyin.
160 mikrolitre BRD4'ü çalışan tampondaki iki mikromolde soldaki sonraki dört kuyucuğa pipetleyin. Daha sonra 40 mikrolitreyi B5 kuyusundan B4'e aktarın ve iyice karıştırmak için pipetleyin. Çözeltiyi B1'e kadar her kuyudan aktarmaya devam edin. Şimdi SPR'yi 100 saniyelik bir temas süresi, 720 saniyelik bir ayrışma süresi ve dakikada 50 mikrolitre akış hızı ile tek döngülü kurulumda çalıştırın.
VHL-MZ1 ikili kompleksi ve VHL-MZ1-BRD4 üçlü kompleksinin karakterizasyonu yapıldı. Olumlu bir işbirliği gözlendi. Sereblon, PROTAC ve PPM1D sistemlerinin karakterizasyonu SPR ile yapıldı.
PPM1D deneyleri bir nikel NTA çipi kullanır ve çip yüzeyi her bileşik enjeksiyonundan sonra yenilenir. Sadece sereblona bağlanan BRD-2512 ve sadece PPM1D'ye bağlanan BRD-4761, ihmal edilebilir bir bağlanma tepkisi gösterir. BRD-5110, PPM1D arasında üçlü bir kompleks oluşumunu indükler ve yüksek bileşik konsantrasyonlarında bir kanca etkisi gösterir.
