İncelenecek istenen her bir deneysel koşula karşılık gelen, hazırlanan yaklaşık 100 izole aynalama adacığından oluşan tek bir hücre süspansiyonu ile beta hücre mitofajisinin akış sitometrik analizini gerçekleştirmeye devam edin. İlk olarak, her koşul için adacık örneklerini 500 mikrolitre adacık akış ortamında yeniden süspanse edin. MtPhagy boyasını almak üzere belirlenmiş tüplere 0,25 mikrolitre MtPhagy stoğu ekleyin.
Benzer şekilde, ilgili belirtilen tüplere 0.25 mikrolitre TMRE stoğu ve fluozin-3-stoğu ekleyin. Tüpleri alüminyum folyoya sarın ve içindekileri karıştırmak için her tüpü beş saniye boyunca düşük hızda girdaplayın. Daha sonra tüpleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
İnkübasyonun yarısında, her numuneyi beş ila 10 saniye boyunca düşük hızda vorteksleyin. İnkübasyondan sonra, tüpleri 10 santigrat derecede bir dakika boyunca 350 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
Ve numuneleri 500 mikrolitre adacık akış ortamında yeniden süspanse edin. DAPI tedavisi gerektiren numuneleri içeren mikrosantrifüj tüplerine DAPI ekleyin. Tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı daha önce gösterildiği gibi atın.
Kalıntıyı 500 mikrolitre adacık akış ortamında yeniden süspanse edin. Son olarak, numuneleri buz üzerine yerleştirin ve ardından akış sitometrisi ile devam edin. Hücre popülasyonlarının dağılım grafiğinin merkezinde olduğundan emin olmak için ileri saçılma veya FSC ve yan saçılma veya SSC voltajlarını ayarlayın.
Çokları hariç tutmak için, FSC yüksekliğine karşı FSC genişliğine karşı dikdörtgen bir kapıda, ardından SSC yüksekliğine karşı SSC genişliği. Canlı beta hücrelerini filtrelemek için DAPI'nin voltajlarını ve kompanzasyonunu ayarlayın. Boyanmamış RFD örneğine dayalı olarak kullanılan her florofor için floresan kapıları ayarlayın.
Kapılar kurulduktan sonra, örnek başına 10.000 olay toplayın. Mitofaji kullanımının yüksek olduğu beta hücreleri, üçüncü çeyrek veya Q3'te fluozin yüksekliği, MtFaji yüksekliği, TMRE düşüklüğü olarak tanımlandı. Bazal ve valinomisine bağlı mitofaji düzeyleri hem RFD hem de HFD adacıklarında karakterize edildi.
