Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic β-Cells Using the Genetically Encoded mt-Keima Reporter

Genetik olarak kodlanmış mitofaji raportörünü kullanarak murin pankreas beta hücrelerinde mitofajiyi değerlendirmek için, 37 santigrat derecede gece boyunca vahşi tip ve Mt-Keima farelerinden izole edilen kültür pankreas adacıkları. Ertesi gün, bu protokolde kullanılan her deneysel koşul için iki mililitre adacık ortamı içeren altı santimetrelik bir Petri kabına 100 adacık ekleyin. Daha sonra, delikleri tek hücrelere ayırmak ve daha önce Mt-Fagy boya bazlı yaklaşım için gösterildiği gibi FluoZin-3-ve DAPI ile boyamak.

Ardından numunelerin akış sitometrik analizine devam edin. Bir SSCA'ya karşı FSCA grafiğinde hücrelerin eşit dağılımını elde etmek için ileri saçılma veya FSC ve yan saçılma veya SSC voltajlarını ayarlayın. Tek hücreleri seçmek ve çokları hariç tutmak için, FSC yüksekliğine karşı FSC genişliğine dikdörtgen bir geçit ve ardından SSC yüksekliğine karşı SSE genişliği ekleyin.

Çoklayıcılar, daha yüksek genişlik sinyal değerleri nedeniyle hariç tutulur. Ardından ölü hücreleri dışlamak için bir DAPI negatif kapısı ayarlayın. Bundan sonra, canlı beta hücrelerini filtrelemek için FluoZin-3-pozitif kapıları ayarlayın.

Asidik ve nötr hücre popülasyonlarını tanımlamak için Mt-Keima pozitif örneğini kullanarak bir üçgen geçit şeması oluşturun. Birincil ve floresan kapıları kurulduktan sonra, Mt-Keima floresansında bazal ve valinomisin kaynaklı değişiklikleri kullanarak mitofaji akısını değerlendirin.