Donmuş çözünen madde taşıyıcılarını veya SLC hücre peletlerini oda sıcaklığında bir su banyosunda çözdürerek başlayın. 135 mililitre baz tamponu ve üç proteaz inhibitörü kokteyl tabletini birleştirerek çözündürme tamponu hazırlayın. Tabletler çözüldükten sonra, peleti çözündürme tamponunda yeniden süspanse edin.
Daha sonra deaminaz ekleyin ve süspansiyonu buzla soğutulmuş bir homojenizatöre aktarın. Homojenizatörü buz üzerinde tutarak pistonu yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek çözeltiyi homojenize edin. Ardından, %1 nihai konsantrasyona kadar deterjan stok solüsyonu ekleyin.
Çözündürme karışımını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede yavaşça döndürün. Bir saat sonra, karışımı santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın. Dört ila altı mililitrelik bir Strep-Tactin reçinesi yatak hacmini baz tampon ile dengeleyin.
Daha sonra çözündürülmüş süpernatanıma dengelenmiş reçine ekleyin ve dört santigrat derecede iki saat döndürün. Çözeltiyi bir yerçekimi akış kolonuna dökün ve çözeltinin akmasına izin verin. Strep Wash Buffer'ın yatak hacminin 30 katı kadar reçineyi üç eşit adımda yıkayın.
Ardından, üç ila beş mililitre illüzyon tamponu ekleyin ve elute'yi toplamadan önce 15 dakika inkübe edin. UV emici spektroskopisi ile protein konsantrasyonunu ölçün. İstenilen illüzyon fraksiyonlarını birleştirin ve 3C proteaz ekleyin.
Tüpü gece boyunca dört santigrat derecede yavaşça döndürün. Ertesi gün, iki ila dört mililitre kobalt metal afinite reçinesinin yatak hacmini SEC tamponu ile dengeleyin. Dengelenmiş kobalt metal afinite reçinesini gece boyunca 3C reaksiyon karışımına ekleyin ve dört santigrat derecede döndürün.
Bir saat sonra, çözeltiyi bir yerçekimi akış kolonuna dökün ve akışı toplayın. Dört santigrat derecede 3000 g'da döndürerek akışı 100 kilodaltonluk bir kesme santrifüj filtresinde yoğunlaştırın. SEC tamponlu dengeli dekstran argos tabanlı SEC sütunu.
Numuneyi numune döngüsüne enjekte edin ve SEC programını, kolon basıncı kolon üreticisinin spesifikasyonlarının altında olacak şekilde bir akış hızıyla çalıştırın. Bir kesir toplayıcı kullanarak, tüm SEC çalışması boyunca 300 mikrolitrelik kesirler toplayın. Tepe fraksiyonlarını bir araya getirdikten sonra, absorbansı 280 nanometrede ölçün.
Daha sonra numuneleri 100 kilodaltonluk bir kesme filtresinde gerekli hacme konsantre edin. İlk küçük ölçekli SLC protein ekspresyonu SDS sayfa elektroforezi ile analiz edildi. GFP etiketli SLC'nin floresan mikroskobu, önemli hücre içi birikime sahip plazma membranına özgü protein lokalizasyonunu doğruladı.
Kimyasal ve yapısal olarak homojen protein, boyut dışlama kromatografisi sırasında tek bir mono dispers A280 piki verdi.
