Başlamak için, fareye AAV ile ilişkili vektörleri fare beynine enjekte edin. Üç ila dört haftalık virüs enjeksiyonundan sonra, anestezi uygulanmış bir farenin boynunun ventral ve sırt bölgelerini tıraş edin. Traş edilen alanları% 70 etanol çözeltisi ile dönüşümlü olarak üç iyot fırçası kullanarak temizleyin.
Omuz bıçakları arasındaki deride ventral bir kesi yapın. Daha sonra, cerrahi gazlı bezi insizyonun üzerine yerleştirin ve hayvanı başı cerraha bakacak şekilde sırtüstü pozisyonda konumlandırın. Ardından, sağ karotis arteri ve juguler veni ortaya çıkarmak için boynun sağ tarafında, klavikula üzerinde küçük bir dikey kesi yapın.
Cilt altı dokusunu ayırdıktan sonra, sağ dış juguler veni ortaya çıkarın ve dikişi damarın altına yerleştirin. Kan akışını durdurmak için juguler venin distal ucunu bağlayın. Mikro forseps ve makas kullanarak çöken damarda küçük bir kesi yapın.
Şimdi, venöz kateteri eğim aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve sağ atriyuma ulaşana kadar proksimal olarak superior vena kavaya doğru hareket ettirin. 7-0 ipek sütür kullanarak kateteri damara sabitleyin. Sağ ortak karotis arteri ortaya çıkarmak için bağ dokularını inceleyin.
Proksimal olarak, iç ve dış karotis arterlerin bölündüğü seviyede açılmamış kalan iki adet 7-0 ipek sütür halkasını önceden yerleştirin. Kan akışını geçici olarak durdurmak için, önceden yerleştirilmiş bir dikiş halkası çekin. Ardından, mikro makas veya 27 gauge iğne kullanarak damar duvarında küçük bir açıklık oluşturun.
Sütür halkasını serbest bırakırken arteriyel kateteri proksimal olarak yerleştirin ve aort kapağına dokunmadan kateteri aort kemerine ulaşacak şekilde ilerletin. Kateteri damara sabitlemek için önceden yerleştirilmiş iki sütür kullanın. Tüm kateterleri deri altından tünelleyin, önceden kesilmiş kesiden boynun arkasına çıkarın ve ventral kesiyi kapatın.
Kateterleri, 25 gauge iğne borusundan yapılmış silikon kaplı boru konektörünün venöz veya arteriyel portlarına birleştirin. Ventral insizyonu kapattıktan sonra, arka deri dikişlerle kapatıldığında konektörü deri altından sabitleyin. Paslanmaz çelik cerrahi teller kullanarak kateterleri heparinize salinle doldurun ve kateterlerin uçlarını sıkıca kapatın.
Hayvanı ameliyattan 24 saat sonra otomatik bir kan alma sistemine bağlamak için, bağlama kancasını boynun arkasındaki metal halkaya bağlayın ve arter hattını bağlayın. Arteriyel kateter enjeksiyon hattına bağlandıktan sonra, venöz kateterleri örnekleme hatlarına takın. Enjeksiyon süresini ve dozunu dakikada 500 mikrolitrede kilogram başına 0.5 miligram olarak ayarlayın.
Numunenin salinle seyreltilmesi de dahil olmak üzere kan örnekleme süresini ve sıklığını ayarlayın. Sistem, örneklenen kanı değiştirmek için otomatik olarak eşit miktarda salin dolduracaktır. Otomatik ön enjeksiyon gerçekleştirin.
Daha sonra, dakikada 500 mikrolitrelik bir enjeksiyon hızında ilaç klozapin N-oksitin otomatik bir intravenöz enjeksiyonunu gerçekleştirin. Ardından enjeksiyon sonrası kan örneklemesi yapın. Kavisli çekirdekte tek taraflı stereotaksik AAV-hM3Dq-mCherry enjeksiyonu alan yetişkin Kiss1-EYFP dişilerinde luteinize edici hormon paternleri sunulmuştur.
Diestrus luteinize edici hormon seviyeleri genellikle düşüktür, ancak pulsatil salınımı nedeniyle genellikle varyasyonlar gözlenir. Klozapin N-oksit enjeksiyonuna yanıt olarak luteinize edici hormon seviyelerinde keskin bir artış meydana gelir. Kiss1-EYFP ile birlikte lokalize edilen çoğu mCherry nöronu, viral ve nöronal aktivasyonun hedeflenen popülasyona özgü olduğunu göstermiştir.
Diestrus vahşi tip farelerde luteinize edici bir hormon pulsatil salınım paterni ve ardından bir Kisspeptin-10 IP enjeksiyonuna yanıt gösterilmiştir. Düşük bazal luteinize edici hormon seviyeleri gösteren, diestrus'ta bir kadın için tipik olan berrak luteinize edici hormon darbeleri gözlendi. Kisspeptin uygulamasına yanıt olarak luteinize edici hormonda ani ve sağlam bir artış tespit edildi.
