Başlamak için, bir bardak Dounce'u %0.01 digitonin içeren iki mililitre buz gibi soğuk çekirdek lizis tamponu ile doldurun ve diseke fare beyin dokusu parçalarını içine ekleyin. Bir cam Dounce doku homojenizatörü kullanarak, dokuyu her biri A ve B tokmakları ile 25 kez homojenize edin ve elde edilen homojenatı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Homojenata iki mililitre% 0.01 digitonin içeren buz gibi soğuk çekirdek lizis tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
Ardından, çekirdekleri 500 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Bir mikropipet kullanarak, süpernatanı çıkarın ve% 0.01 digitonin içeren dört mililitre buz gibi soğuk çekirdek lizis tamponu ekleyin. Çekirdek süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün.
Çekirdekleri tekrar santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve çekirdekleri yıkamak için dört mililitre boyama tamponu ekleyin. Süspansiyonu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzdükten sonra, çekirdekleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve çekirdekleri% 0.04 BSA ve RNaz inhibitörleri içeren bir mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri saymak için, 0,5 mililitrelik bir tüpte 10 mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ile 10 mikrolitre çekirdeği karıştırın.
Otomatik bir hücre sayacı kullanarak çekirdekleri sayın. Boyanmamış kontrol için 100 mikrolitre çekirdeği bir FACS tüpüne aktarın. Kalan çekirdeğe 10 mikrolitre 7-AAD ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika inkübe edin ve FACS kullanarak çekirdek sıralamasına devam edin.
Ardından, sıralanan çekirdeklerin 10 mikrolitresini,% 2 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ile 90 mikrolitre DPBS içeren yeni bir FACS tüpüne aktarın. Sıralanan çekirdekleri santrifüjledikten sonra, bir mikropipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve çekirdekleri 100 mikrolitre seyreltilmiş çekirdek tamponunda yeniden süspanse edin. Ayırmadan önce, numune, tekillerin %99'undan fazlasının nükleer leke için pozitif olduğu ve etkili hücre lizizini gösteren önemli kalıntılar içerir.
Tasniften sonra beyin çekirdekleri, başlangıçtaki %36'dan yaklaşık %100'e kadar saflıkta bir artış gösterdi
