Başlamak için, hematoksilen ve eozin lekeli sıçan burun mukozal dokusu bölümlerini mikroskop aşamasına yerleştirin. Görüntü net bir şekilde görünene kadar mikroskobun odağını ayarlayın. Doku görüntüsünü 40X'te yakalayın.
Sitrat fosfat tamponunu kaynayana kadar ısıtın. Ardından slaytları ocaktan aldıktan sonra kaba ekleyin. Kaynayana kadar sekiz dakika ısıttıktan sonra, ısıyı sekiz dakika kapatın ve ardından yedi dakika orta kısık ateşe geçin.
Kabın doğal olarak soğumasına izin verdikten sonra dilimleri PBS'ye aktarın. Dilimleri beş dakika sallamak için renk giderici bir çalkalayıcı kullanın. Daha sonra immünohistokimyasal bir kalemle kurutulmuş dokunun etrafına bir daire çizin.
İnkübe etmeden önce dilimlere% 3 hidrojen peroksit çözeltisi ekleyin. Ardından dilimleri daha önce olduğu gibi yıkamak için PBS'ye aktarın. Engellemek için, işaretli daire için% 5 keçi serumu uygulayın.
İnkübasyondan sonra, bloke edici çözeltiyi dikkatlice çıkarın ve doku dilimlerine bir ila iki mililitre FOXP3 ekleyin. Daha sonra dilimleri gece boyunca inkübasyon için nemli bir odaya yerleştirin. Dilimleri PBS'de yıkadıktan sonra, dilimleri filtre kağıdı ile nazikçe kurulayın.
Daha sonra dilimlere bir ila iki mililitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Daha sonra dilimleri karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 100 mikrolitre tiramid sinyal amplifikasyon çalışma solüsyonunda inkübe edin. İnkübasyondan sonra, dilimleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
Şimdi inkübasyondan önce dilimlere bir ila iki mililitre DAPI boyama solüsyonu uygulayın. 10 dakikalık bir PBS yıkamasından önce dilimleri söndürücüde beş dakika inkübe ederek otomatik floresansı söndürün. Ardından bunları anti floresan söndürücü ile kapatın.
20X ve 40X büyütme altında lekeli bölümlerin mikroskobik görüntülerini yakalayın. Kontrol sıçanlarının hematoksilen ve eozin boyaması iyi düzenlenmiş epitel hücreleri ve kirpikler gösterdi. Nazal septum mukozası, kayda değer nötrofil infiltrasyonu olan hastalık grubunda hasar görmüş ve ayrılmıştı.
Çoklu immünofloresan boyama, hastalık grubunda ROR Gamma T ve TCAM1 ekspresyonlarının arttığını ortaya koydu. Ancak, FOXP3 yeterince ifade edilmedi.
