Ultra temiz bir tezgahta steril koşullar altında çalışırken limbal niş hücrelerinin veya LNC'lerin izolasyonunu gerçekleştirin. Limbus dokusunu orta terim kornea depolama ortamından alın. Steril bir cerrahi yuvarlak bıçak kullanarak, kornea çevresindeki iris ve endotelyumu kazıyın ve çıkarın.
Daha sonra, steril cerrahi yuvarlak bıçakla, limbus dokusunu 12 eşit parçaya bölün ve kornea ve skleranın her iki tarafında sadece bir milimetre doku bırakın. Bundan sonra, 12 limbus doku parçasını 35 milimetrelik bir kültür plakasına aktarın ve dokuları plakaya tamamen daldırmak için 1 mililitre kollajenaz A ekleyin. Kültür plakasını 37 santigrat derece hücre inkübatörde 18 saat inkübe ederek dokuları sindirin.
Matrigel veya bazal membran matrisini 4 santigrat dereceye ayarlanmış bir buzdolabında çözdürün. 200 mikrolitre ve 1 mililitre uç, 15 mililitre santrifüj tüpü ve 6 kuyulu plaka içeren sterilize bir torba hazırlayın ve torbayı 20 dakika boyunca eksi 20 veya eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin. Soğutucudan uçları, santrifüj tüpünü ve 6 kuyulu plakayı aldıktan sonra, ultra temiz bir tezgah üzerinde sonraki adımları gerçekleştirmeye devam edin.
Önceden soğutulmuş 200 mikrolitrelik bir uç kullanarak, çözülmüş bazal membran matrisinin 50 mikrolitresini 1 mililitre MESCM'ye pipetleyin ve hafifçe karıştırın. Bir pipete takılı, önceden soğutulmuş, 1 mililitrelik bir uç kullanarak, elde edilen %5 bazal membran matrisini önceden soğutulmuş 6 kuyulu kültür plakasının tek bir kuyucuğuna aktarın. % 5 matrigel kaplı kültür plakasını hazırlamak için yaklaşık bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirmeden önce 6 kuyulu plakayı yatay olarak hafifçe sallayın.
18 saatlik sindirimin ardından, çoğunlukla küçük görünür kümeler içeren sindirilmiş limbal doku olan kollajenaz A'yı alın. Stereo mikroskop altında çalışarak, kümeleri sindirilmemiş skleral dokulardan ayırmak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Ayrılmış kümeleri 35 milimetrelik bir kültür plakasına% 0.25 Tripsin-EDTA'ya batırın ve plakayı 15 dakika inkübe edin.
Ardından, hücre sindirimini söndürmek için tabağa %10 nakavt serumu içeren 1 mililitre MESCM ekleyin. Kümeleri ayrı hücrelere ayırmak için süspansiyonu 1 mililitrelik bir pipet ucuyla hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.
Hücre peletini bozmadan, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mililitre MESCM ekleyin. 1 mililitrelik bir pipet ucu kullanarak, tüm peletin MESCM'de yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için içeriği iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre sayımı için süspansiyondan 20 mikrolitre toplayın.
Daha sonra, 1 mililitrelik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu %5 bazal membran matrisi kaplı 6 kuyulu plakaya aktarın. Kuyudaki toplam hacmi 2,5 mililitre yapmak için MESCM ekleyin. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için 6 kuyulu plakayı yatay olarak hafifçe sallayın.
Hücreleri görüntüledikten sonra, onları 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Gösterilen protokol, kornea skleral kenar dokusunu başarılı bir şekilde sindirdi ve mikroskop altında görüntülenebilen kümeler oluşturdu. Beklendiği gibi, kümeler bir tırtıl şekline benziyordu.
Birincil LNC'ler yavaş büyüdü ve kültür için yaklaşık 12 gün sürdü. Geçiş 1'den geçiş 8'e kadar olan LNC'lerin geçiş için yaklaşık üç güne ihtiyacı vardı, ancak geçiş 9'dan sonra LNC'lerin büyüme hızı önemli ölçüde azaldı. Morfolojik olarak, LNC'ler iğ şeklindeydi ve 0 geçişinde yuvarlaktı.
3. geçişten sonra, tek tip boyutlarda iğ şeklindeydiler. Hücre ikiye katlanma sayısı veya NCD, LNC'lerin büyüme oranını temsil ediyordu. NCD ve birikimli NCD eğrileri, LNC'lerin pasaj 3'ten pasaj 5'e kadar en hızlı büyüdüğünü ortaya koydu.
