Limbal niş hücrelerini veya LNC'leri immünofloresan boyama ile tanımlamak için,% 5 matrigel kaplı 6 oyuklu bir plakada kültürlenen LNC'lere oyuk başına 1 mililitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede beş dakika inkübe ederek hücreleri sindirin. Hücre süspansiyonuna MESCM içeren 1 mililitre nakavt serumu ekleyerek sindirimi söndürün.
Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve süpernatanı dikkatlice aspire etmeden önce beş dakika boyunca 200G santrifüjleyin. Peletleri bir mililitre MESCM içinde tekrar süspanse edin. Daha sonra, bir sitofüj kullanarak, üreticinin talimatına göre dört mikroskop lamına eşit olarak 80 mikrolitre hücre süspansiyonu bırakın.
Hücreleri yaklaşık 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitleyin. Daha sonra PBS'de% 0.2 Triton X-100 kullanarak slaytlardaki hücrelere 15 dakika boyunca geçirgenlik sağlayın. Hücreleri, 4 santigrat derecede bir gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde birincil antikorlarla inkübe etmeden önce% 2 sığır serum albümini ile bir saat bloke edin.
İnkübasyon sonrası, slaytları PBST ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayarak bağlanmamış antikorları çıkarın. Daha sonra, daha önce gösterildiği gibi bağlanmamış antikorları yıkamadan önce numuneyi 37 santigrat derecede bir saat boyunca uygun ikincil antikorlarla inkübe edin. Çekirdekleri mililitre başına 5 mikrogram konsantrasyona sahip DAPI ile karşı boyayın.
Slaytları kapattıktan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleme yapın. Bir RNA izolasyon kiti kullanarak, üreticinin talimatlarına göre LNC'lerden toplam RNA'yı çıkarın. Daha sonra yüksek kapasiteli bir tamamlayıcı DNA veya CDNA transkripsiyon kiti kullanarak, RNA'nın 1 ila 2 mikrogramını ters kopyalayın.
2.5 mikrolitre CDNA, 0.8 mikrolitre karşılık gelen genetik primer, 10 mikrolitre evrensel PCR ana karışımı ve 6.7 mikrolitre çift damıtılmış su içeren 20 mikrolitrelik bir çözelti hazırlayın. Daha sonra uygun koşulları kullanarak kantitatif bir polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirin. Son olarak, göreceli gen ekspresyonunu incelemek için karşılaştırmalı BT tekniğini kullanın.
Dördüncü pasajlı LNC'lerin çift immün boyanması, bu hücrelerin tutarlı bir şekilde panCK negatif, VIM pozitif, CD90 pozitif, CD105 pozitif, SCF pozitif ve PDGFR pozitif olduğunu açıkça ortaya koydu.
