Calcium Imaging of Drosophila Ex Vivo Brain for Epileptiform Analysis

Başlamak için, harici çözeltiyi beş dakika boyunca oksijenli salin ile perfüze edin. Bir pipetle, 10 mikrolitre diseksiyon solüsyonunu bir Petri kabına aktarın. Şimdi, anestezi uygulanmış vahşi tip ve nakavt sineklerin beyinlerini dikkatlice incelemek için şırınga iğneleri ve mikroskop kullanın.

Bir pipetle, hazırlanan beyni beş mililitre harici çözelti içeren bir kayıt kabına aktarın. Beyinleri bir C keskin tutucu ile hareketsiz hale getirin. Ardından, her beynin konfokal görüntüsünü 20x'te yakalayın.

XYT tarama modunu kullanın ve mantar gövdesi nöronlarını 4,5 kat daha fazla dijital amplifikasyonda tanımlayın. Tüm beyin GCaMP6m emisyonunu elde etmek için lazer uyarımını 16 mikro watt lazer gücüyle 488 nanometreye ayarlayın. Ardından tarama parametrelerini 256 x 256 piksel boyutuyla 1400 hıza ayarlayın.

Alım hızını 5,3 hertz olarak ayarlayın ve üç dakika boyunca kaydedin. İlgilenilen beş ila sekiz bölgenin floresansını analiz edin. Mantar gövdesi nöronlarının hücre gövdesini ilgilenilen bölge olarak manuel olarak belirleyin.

Tanımlanan nöronları etiketlemek ve floresan yoğunluklarını ölçmek için J görüntüsünü kullanın. GCaMP6m'nin floresan verilerini gösterildiği gibi analiz edin. İki ila 2.5 standart sapma arasında artan hücre içi floresansı küçük sivri uçlar ve 2.5 standart sapmadan fazla artanları büyük sivri uçlar olarak tanımlayın.

Sineklerin mantar gövdesinde kalsiyum sinyalleri gözlendi. Cac knockdown sinekleri, küçük sivri uçlardan daha büyük sivri uçlar gösterdi.