Başlamak için, büyüme faktörü azaltılmış hücre dışı matris jeli ile kaplanmış altı oyuklu bir doku kültürü plakası üzerinde IPSC bakım ortamındaki kültür hiPSC'leri. Hücreler% 80 ila 90 v'ye ulaştığında, ortamı plakadan çıkarın ve hücreleri bir kez DPBS ile yıkayın. Daha sonra 700 ila 800 mikrolitre 0.48 milimolar EDTA ekleyin ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin.
Sindirim solüsyonunu çıkarın ve plakayı 37 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edin. Hücreler tabakalar halinde sindirildiğinde, sindirimi sonlandırmak için iki mililitre IPSC bakım ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu altı kuyulu düşük bir bağlantı plakasına aktarın.
Küresel embriyo gövdeleri veya EB'ler oluşturmak için hücreleri% 5 karbondioksit ve 60 RPM ile 37 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat sonra, geçmiş bir pipet kullanarak, EB'leri santrifüj tüpüne aktarın ve süpernatanı çıkarmadan önce beş ila 10 dakika çökelmesine izin verin. Tüpe MSC farklılaşma ortamı ekleyin ve EB'leri iki mililitre MSC farklılaşma ortamı ile altı kuyulu düşük bağlantı bıçağına aktarın.
EB'leri çalkalayıcı üzerinde yedi gün boyunca %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kültürleyin. Sekizinci günde, EB'leri daha önce gösterildiği gibi santrifüj tüpüne aktarın. EB'ler çökeltildikten sonra, süpernatanı tüpten çıkarın.
Tüpe MSC bakım ortamı ekleyin ve EB'leri, iki mililitre MSC bakım ortamı ile büyüme faktörü azaltılmış hücre dışı matris jel kaplı altı oyuklu bir plakaya aktarın. Hücre yapışmasından sonra, kültür% 90 birleşmeye ulaşana kadar ortamı değiştirin. Daha sonra, EB'den türetilmiş kültürü 37 santigrat derecede bir ayrışma çözeltisi ile işlemden geçirin.
Hücrelerin bir kısmı tek hücrelere sindirildiğinde, sindirimi sonlandırmak ve hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarmak için iki mililitre MSC bakım ortamı ekleyin. Kalan sindirilmemiş hücreleri kuyulardan bir kez DPBS ile yıkayın. Ve daha önce gösterildiği gibi tekrar sindirin.
Daha sonra hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 250 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri jelatin kaplı bir kültür plakasında tohumlayın. MSC bakım ortamındaki hücreleri, düzenli ortam değişimi ile% 90'a kadar kültürleyin.
Daha önce gösterildiği gibi kültür hiIPC çizgileri. Hücreler %50 ila %60 birleşmeye ulaştığında, IPSC bakım ortamını plakadan çıkarın. İki mililitre MSC bakım ortamı ekleyin.
Ve 14 gün boyunca 37 santigrat derecede ve günlük ortam değişimi ile% 5 karbondioksitte kültür. MSC'lerin olgunlaşması için, tek katmanlı kültüre 37 santigrat derecede bir ayrışma çözeltisi uygulayın. Hücrelerin bir kısmı tek hücrelere sindirildiğinde, sindirimi sonlandırmak ve hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarmak için kuyucuklara iki mililitre MSC bakım ortamı ekleyin.
Kalan sindirilmemiş hücreleri DPBS ile bir kez yıkayın ve daha önce gösterildiği gibi sindirin. Daha sonra hücre süspansiyonunu daha önce gösterildiği gibi santrifüjleyin ve hücreleri jelatin kaplı bir kültür kabına tohumlayın. MSC bakım ortamındaki hücreleri, düzenli ortam değişimi ile% 90'a kadar kültürleyin.
EB oluşum yönteminde, hiIPC kolonileri farklılaşmadan önce kompakt bir morfoloji sergiledi. Ayrışmadan sonra, zamanla hacim kazanan tek tip küresel EB'ler oluştu. Daha sonra, EB'ler 18. güne kadar %90 birleşme elde eden ve iki geçişten sonra bir iğ şekli morfolojisi elde eden yapışık tek katmanlı hücrelere dönüştü.
Benzer şekilde, tek tabakalı yöntemde, hücreler çoğalarak çok katmanlı yapışık hücreler oluşturmuştur. Birden çok kez paketlendikten sonra, hücreler tipik bir iğ şekli ve dönen koloni ile MSC'ye olgunlaştı. Flow sitometri analizinde hiIPC'lerin CD90 için pozitif, CD34, CD45, CD105 ve CD73 için negatif olduğu saptandı.
Farklılaşmadan sonra, MSC'leri çalıştıran hiIPC'ler CD90, CD73 ve CD105'i eksprese ederken, CD34 ve CD45 için negatif kaldı. Tek tabaka kaynaklı MSC'ler, EB yöntemine göre daha yüksek kalsiyum depozit oluşumu göstermiştir. Bununla birlikte, adipojenik ve kondrojenik farklılaşma yeteneklerinde anlamlı bir fark gözlenmedi.
Her iki yöntemin de proliferasyon yetenekleri 20 pasaja kadar korundu.
