İndirgeyici metilasyon yoluyla havuzlanmış protein fraksiyonlarını kimyasal olarak değiştirerek başlayın. Bunu yapmak için, saflaştırılmış proteini alın ve 20 milimolar dimetilamin boran ve ardından 40 milimolar formaldehit ekleyin. Karışımı salınımlı çalkalayıcıda dört santigrat derecede iki saat inkübe edin.
Ardından, karışıma ilave bir 10 milimolar dimetilamin boran ekleyin. Daha sonra, karışımı gece boyunca dört santigrat derecede 12 ila 18 saat inkübe edin. pH'ı 7.5 olan 100 milimolar tris klorür ekleyerek reaksiyonu söndürün.
Metillenmiş proteini bir nikel-NTA kolonuna yüklemek için uygun yıkama tamponunu ve elüsyon tamponunu kullanın. İlk olarak, iki mililitre nikel-NTA kolonunu 10 kolon hacminde yıkama tamponu ile yıkayın. Ve sonra, proteini elüsyon tamponu ile elüte edin.
Elüsyonu takiben, protein elüatını uygun tampon ile önceden dengelenmiş bir PD-10 tuzdan arındırma kolonundan geçirin. Tuzdan arındırılmış proteine izopropanol veya etanol içinde hazırlanan kolesterolü ekleyin ve karışımı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, karışımı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 150.000G'de ultrasantrifüjleyin.
Toplanan süpernatanı 100 kilodaltonluk bir kesme ile santrifüjlü bir yoğunlaştırıcıya ekleyin ve süpernatanı mililitre başına 30 ila 50 miligramlık bir nihai konsantrasyona konsantre edin. Bir kez daha, konsantre proteini yüksek hızlı bir tezgah üstü soğutmalı santrifüj kullanarak santrifüjleyin ve peleti çıkarın. Kristalleşmeyi ayarlamaya devam etmeden önce toplanan süpernatanı dört santigrat derecede buzun üzerine yerleştirin.
Dört santigrat derecede depolanan alkillenmiş proteinler, bir ay boyunca analitik jel filtrasyon kromatografisi ile analiz edildi. Ve bir hafta sonra hafif bir protein kaybı gösterdi.
