Başlamak için, hücreleri altı oyuklu bir plakada% 10 FBS ve% 5 penisilin-streptomisin içeren DMEM Tam Ortamında kültürleyin. Kültürü bir gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri 10 nanomolar polilisin ile modifiye edilmiş demir oksit nanopartikülleri veya IONP'ler ile birlikte kültürleyin ve 12 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, hücreleri sindirmek için üç dakika boyunca oyuk başına 0.5 mililitre tripsin ekleyin. Ardından, sindirimi durdurmak için oyuk başına bir mililitre Tam Ortam ekleyin. Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 1.000 g'da santrifüjleyin ve peleti PBS'de yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı atın.
Daha sonra peleti sekiz mililitre taze hazırlanmış hipotonik çözelti içinde 15 dakika boyunca tekrar süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir cam test tüpüne aktarın ve bir cam homojenleştirici kullanarak, organelleri serbest bırakmak için 1.000 RPM'de 20 şok uygulayın. Homojenizasyondan sonra, hücre süspansiyonunun bir mililitresini 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
IONP yüklü endozomları diğer organellerden ve hücre kalıntılarından tamamen ayırmak için tüpü bir saat boyunca manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. Endozomları toplamak için, sıvıyı tüpten atın ve endozomları yeniden askıya almak için üç mililitre PBS ekleyin. Ardından, manyetik çerçevenin yanındaki tüpün temas yüzeyinde bulunan kahverengi peletleri yeniden süspanse etmek için üflemek için bir pipet tabancası kullanın.
Yüksek hızlı homojenizasyon için endozom solüsyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Buz kutusunu tüpün altına yerleştirin ve ardından tüpü yüksek hızlı homojenizatöre yerleştirin. 10 mililitrelik probu tabana dokunmadan tüpe yerleştirin.
Homojenizatör ekranında hızı 140 g'a ayarlayın ve süreyi beş dakikaya ayarlayın. OK düğmesine ve ardından Başlat düğmesine basın. Yüksek hızlı homojenizasyondan sonra, nano vezikül süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü bir saat boyunca manyetik bir ayırıcıya yerleştirin.
Son olarak, manyetik çerçevenin yanındaki yüzeyi bozmadan gerekli eksozom mimiklerini veya EM'leri içeren sıvıyı toplayın. NTA ve TEM tarafından analiz edilen BMSC-EM'lerin morfolojisi, bir lipit çift tabakası ile sınırlandırılmış, tipik bir kase şeklinde vezikül benzeri yapı gösterdi. Hem BMSC-EM'ler hem de 293T-EM'ler, yerel EV'lere benzer hidrodinamik çapa sahipti.
Western blotlama sonuçları, BMSC-EM'lerin EV'lerle aynı protein biyobelirteçlerini içerdiğini ve neredeyse hiç plazma membranı kontaminasyonu olmadığını gösterdi. EMS'nin verimi, ultrasantrifüjleme ile hazırlanan yerli EV'lerden önemli ölçüde daha yüksekti. EM'ler, doğal EV'lere benzer bir protein bileşimine sahipti.
