Besleyici hücrelerin kültürlenmesinden yaklaşık bir saat sonra birincil insan hepatositlerinin veya PHH'lerin kaplanmasını gerçekleştirmeye devam edin. Bunu yapmak için, 30 dakikalık besleyici hücre kültüründen sonra, önceden ısıtılmış hepatosit çözme ortamını 0.2 mikronluk bir polietersülfon filtre ünitesinden süzün. PHH'leri 37 santigrat derece su banyosunda bir ila iki dakika çözdürün.
Çözüldükten hemen sonra, çözülmüş hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, biyolojik bir güvenlik kabininde çalışarak, hücreleri hepatosit çözme ortamına aktarın. 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, çözdürme ortamındaki hepatosit süspansiyonunun bir mililitresini şişeye geri aktarın ve şişeyi hafifçe pipetleme ile üç ila dört kez yıkayın.
Yıkamayı tüp, kapaktaki hücre süspansiyonunun geri kalanıyla birleştirin ve çözülmüş PHH süspansiyonunu beş kez hafifçe ters çevirin. Oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 100 G'de döndürün. Süpernatanı, hücre peletini bozmadan vakum aspirasyonu veya pipetleme yoluyla dikkatlice atın.
Ardından, peleti içeren konik borunun duvarına üç mililitre tam kaplama ortamı ekleyin. Hücre peletini yeniden süspanse etmek için konik boruyu yan yana sallayın ve beş mililitre tam kaplama ortamı ekleyin. Yeniden süspanse edilen hepatositleri saydıktan sonra, tam kaplama ortamı kullanarak hücre süspansiyonunu istenen tohumlama yoğunluğuna ayarlayın.
Daha sonra, önceden kaplanmış besleyici hücreleri içeren kollajen kaplı 24 oyuklu plakayı elde edin ve bir pipet veya vakum aspirasyonu kullanarak ortamı besleyici hücrelerden çıkarın. Besleyici hücreleri içeren her bir oyukta derhal 500 mikrolitre seyreltilmiş hepatosit süspansiyonu koyun. Kuzey-güney yönünde iki kez ileri geri hareket ederek ve ardından doğu-batı yönünde aynı hareketi yaparak plakayı kuzey-güney, doğu-batı hareketiyle sallayın.
Plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte iki ila dört saat inkübe edin. Kültürün ilk 60 dakikası için, daha önce gösterildiği gibi her 15 dakikada bir plakayı sallayın. İnkübasyonun ardından, plakayı inkübatörden biyolojik güvenlik kabinine aktarın.
Plakayı salladıktan sonra, tüm kaplama ortamını çıkarmak için pipetleme veya vakum aspirasyonu kullanın. Hemen her bir oyuğa 500 mikrolitre önceden ısıtılmış tam kültür ortamı ekleyin. Besleyici hücrelerle çeşitli tohumlama yoğunluklarında kültürlenen iki donörden alınan PHH'lerin görüntüleri, kültürün yedinci ve 14. gününde elde edildi.
Çeşitli tohumlama yoğunlukları, birleşmenin görsel farklılıklarını gösterdi, ancak tipik hepatik küboidal morfolojiyi korudu.
