Serolojik bir pipet kullanmaya başlamak için, büyüme ortamını %70 birleşik MDA-MB-231 kültürü içeren T75 şişesinden çıkarın. Şişeye üç mililitre tripsin ekleyin ve hücreleri şişeden ayırmak için üç ila beş dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 derecede inkübe edin. Daha sonra tripsini nötralize etmek için, şişeye üç mililitre DMEM ekleyin.
Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpünde toplayın ve dört dakika boyunca 400 G'de döndürün. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve peleti iki mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
Sekiz kez 10'u beşinci hücrelere 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hacmi bir mililitreye çıkarmak için PBS ekleyin. Daha sonra tüpe iki mikrolitre CFSE ekleyin ve bir mililitrelik bir pipet kullanarak hücre süspansiyonunu iyice karıştırın. Tüpü 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörünü 20 dakika boyunca yerleştirin.
Daha sonra, tüpe beş mililitre DMEM ekleyin ve CFSE etiketli hücreleri peletlemek için santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti bir mililitre DMEM'de yeniden süspanse edin. Hücre konsantrasyonunu yeniden değerlendirdikten sonra, 25 mililitrelik bir reaktif rezervuarına dört kez 10 ila beşinci hücreye aktarın.
Hacmi sekiz mililitre yapmak için DMEM ekleyin ve hücre süspansiyonunu beş mililitrelik serolojik pipetle karıştırın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu siyah bir plakanın sol yarısındaki her sıraya 100 mikrolitre hücre süspansiyonu aktarın. Benzer şekilde, plakanın sağ yarısına EGFR nakavt hücresi süspansiyonu ekleyin.
Düzgün hücre dağılımını sağlamak için, plakayı platform üzerinde ileri geri ve yan yana hareket ettirin. Tümör hücrelerinin yapışması için plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte dört saat inkübe edin. Transdüklenmemiş ve CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin sayımlarına dayanarak, 25 mililitrelik bir rezervuara dört kez 10 ila beşinci CAR-J hücresine aktarın.
Rezervuara iki mililitrelik bir son hacme DMEM ekleyin. 4: 1'lik bir efektör-tümör oranı için, bağlı tümör hücrelerini bozmadan, kuyu kenarı boyunca 100 mikrolitre ortamda oyuk başına dördüncü CAR-J hücrelerine iki kez 10 ekleyin. Daha sonra, kuyu başına 300 mikrolitre hacim elde etmek için tümör ve Jurkat hücreleri içeren kuyucukların yanına 100 mikrolitre DMEM ekleyin.
Jurkat hücrelerinin tümör hücreleri üzerinde eşit dağılımını sağlamak için plakayı gösterildiği gibi hareket ettirin. Ko-kültürün 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kurulmasına izin verin.
