CAR eksprese eden jurkatları CFSE etiketli tümör hücreleri ile birlikte kültürledikten sonra, plakayı bir kağıt havlu üzerinde nazikçe ters çevirin ve CAR-J içeren süpernatantları atmak için hafifçe vurun. Çok kanallı bir pipet kullanarak, propidyum iyot veya PI içeren 100 mikrolitre FluoroBrite DMEM ortamını, yapışan tümör hücrelerini rahatsız etmeden kuyucuklara ekleyin. Daha sonra, her tümör tipinin ilk kuyucuğuna 20 mikrolitre% 20 Triton X ekleyin ve toplam ölü kontrol görevi görür.
Görüntülemeden önce plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 20 dakika inkübe edin. Floresan görüntülemeden sonra, yeşil floresan kanalını kalibre etmek için yalnızca tümör hücrelerinden birini kullanın. Kuyucukların kenarındaki hücreleri hariç tutmak için kuyu maskesini %98'e düşürünYeşil floresan kanalındaki CFSE etiketli tümör hücrelerini tanımlayın ve kuyudaki tüm hücreleri yakalamak için floresan yoğunluğu eşik değerini ayarlayın.
CFSE kanalında tespit edilen kalıntıları hariç tutmak için minimum hücre çapını 25 mikrometre olarak ayarlayın. Ardından, tek tek hücreleri tanımlamak için ayrı dokunma nesnelerini etkinleştirin. Daha sonra, canlı ve ölü hücre popülasyonlarını tanımlamak için kapıları ayarlayın.
CFSE etiketli hücreleri seçin ve x eksenindeki ortalama PI yoğunluğuna karşı y eksenindeki sayımların histogramını oluşturun. Hücreleri daha iyi görselleştirmek için x ekseni değerini ayarlayın ve düşük PI lekeli hücreler ile yüksek PI lekeli hücreler arasında ayrım yapmak için bir ayırıcı çizin. Düşük PI lekeli hücreleri canlı hücreler olarak etiketleyin.
Ardından, x ekseninde alanı olan ve y ekseninde sayılan canlı hücrelere başka bir histogram ayarlayın. Enkaz olmayan hücreleri büyük canlı hücreler olarak etiketleyin. Ardından, hücreleri yakalamak ve kalıntıları filtrelemek için tümörü yalnızca iyi kullanarak başka bir ayırıcı çizin.
Analizi tüm plaka üzerinde çalıştırdıktan sonra, sayıları içeren elektronik tabloyu dışa aktarın. CAR-J'ye maruz kaldıktan sonra kuyuda kalan canlı CFSE etiketli tümör hücrelerinin sayısını belirlemek için büyük hücrelerin sayısını çizin. Son olarak, tek yönlü ANOVA kullanarak istatistiksel analiz yapın.
CAR-J1'in sitotoksisitesi, daha yüksek bir efektör/tümör oranı ile arttı ve dörde bir efektör/tümör oranında %50'den fazla öldürme gözlendi. Modifiye menteşe alanlarına sahip EGFR hedeflemeli CAR yapıları, MDA-MB-231 hücrelerini eksprese eden EGFR'ye karşı antijene özgü öldürme gösterdi ve EGFR nakavt hücrelerine karşı önemli bir öldürme gözlenmedi. CAR yapıları ayrıca PBMC'den türetilen CD3 T hücrelerinde de eksprese edildi.
Bununla birlikte, CD8 menteşe içeren EGFR-CAR ifadesi yoktu. IgG kısa, IgG uzun ve IgG ortamına kıyasla MDA-MB-231 hücrelerine karşı en az sitotoksik gücü gösterdi.
