Kemik iliği hasadına başlamak için, kürkü ve cildi sterilize etmek için ötenazi yapılmış bir fareyi% 75 etanole batırın. Fareyi sırt üstü yatırın ve femur başını korumak için kalçadaki alt ekstremiteleri kesin. Diz eklemindeki bağı kesmek için diseksiyon makası kullanın.
Ardından uyluk kemiği ve kaval kemiğini ortaya çıkarmak için diz eklemini geriye doğru katlayın. Bir forseps ve makasla, kemiklere bağlı kasları, tendonları ve diğer dokuları dikkatlice çıkarın. Kemik iliği matrisini gevşetmek için 5 milimetrelik iğneli bir şırınga ile iliği her iki kemik ucundan geçirin.
Şimdi kemik iliğini 10-15 mililitre RPMI ortamıyla yıkamak için taze bir şırınga kullanın. Kemik iliği hücrelerini 300G'de 20 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 5-10 mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
Süspansiyonu inkübe ettikten sonra, karışıma HBSS hacminin dört katını ekleyin. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600G'de santrifüjleyin. Elde edilen peleti daha fazla kullanım için kullanın.
Nötrofilleri önce sıçan kemik iliği nötrofil izolasyon kiti ile izole edin. Bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde col reaktifi başına% 80-55 mililitre katman. Daha sonra izole edilmiş nötrofilleri veya sıçan kemik iliği nötrofil izolasyon kiti ile izole edilmiş hücrelerin resüspansiyon solüsyonunu tüpe pipetleyin.
Tüpü 800G'de 20 santigrat derecede 40 dakika santrifüjleyin. Steril bir pipetle, %65-70 sınırındaki hücre katmanları da dahil olmak üzere %70 gradyan katmanını toplayın. Hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.
Tüpe 15 mililitre HBSS ekleyin ve içeriğini karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Son olarak, hücreleri peletlemek için tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin. Tek adımlı işlem için, kemik iliği süspansiyonunu doğrudan yoğunluk gradyan tüpüne pipetledikten sonra, daha önce gösterildiği gibi santrifüjleyin.
Ardından, %75-70 gradyan sınırındaki katmanlar da dahil olmak üzere %70 gradyan katmanını pipetleyin. Bu hücre süspansiyonunu 10 mililitre HBSS içeren yeni bir 50 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra hücreleri peletlemek için tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400G'de santrifüjleyin.
İzole edilmiş nötrofilleri bir hemositometre kullanarak sayın ve tripan mavisi boyama yoluyla hücre canlılığını değerlendirin. İki aşamalı yöntem, tek aşamalı yöntemle elde edilen %50'ye kıyasla %90'lık gelişmiş bir saflık seviyesine sahipti.