Başlamak için, izole edilmiş sıçan nötrofillerini steril bir 10 santimetrelik Petri kabında dört mililitre takviyeli RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, NET oluşumunu tetiklemek için nötrofil süspansiyonuna dört mikrolitre PMA ekleyin. Karışımı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında üç saat inkübe edin.
Negatif kontrol için, salgılanan NET'leri parçalamak için nötrofil süspansiyonuna dört ila beş mikrolitre DNASE1 ekleyin. Ardından, NET'leri yıkamak için dört mililitre HBSS ekleyin. NET'leri ayırmak için plakayı her plaka için dört mililitre taze kültür ortamı ile yıkayın.
Şimdi, yıkama ortamını yeni bir tüpte toplayın ve NET'lerin tamamen yeniden süspansiyonunu sağlamak için sık sık pipetleyin. Yüzen hücreleri çıkarmak için süspansiyonu 300 g'da 20 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatan ortamı NET'lerle yeni bir tüpte toplayın.
NET'lerin ve yüzen hücrelerin süspansiyonunu, yüzen hücreleri yerleştirmek için içine yerleştirilmiş 1,4 santimetre cam kapak kızakları ile 24 oyuklu bir plakada santrifüjleyin. Ardından, hücreleri %4 PFA ile lamel fişlere sabitleyin ve NET'lerin varlığını doğrulamaya devam edin. Ardından, parafin film kaplı bir test tüpü standına bir damla HBSS yerleştirin.
Yıkamak için kapak kızağını HBSS damlacıklarına ters çevirin. Yıkamadan sonra, hücreleri geçirgenleştirmek için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 mikrolitre 0.5x Triton X-100 içinde inkübe edin. Ardından, hücreleri bir dakika boyunca HBSS'de üç kez yıkayın.
Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca% 10 normal eşek serumunda kapatın. Son olarak, hücreleri gece boyunca dört santigrat derecede 70 ila 90 mikrolitre anti-sıçan antikoru ile inkübe edin. Kapak fişini HBSS'de her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
Şimdi, bir HBSS'yi yıkamadan önce ikincil antikorlardaki kapak kaymasını oda sıcaklığında karanlıkta bir saat inkübe edin. Hücre çekirdeklerini ve NET iskeletlerini 70 ila 90 mikrolitre DAPI ile boyayın. HBSS yıkamasını her biri beş dakika boyunca üç kez gerçekleştirin.
