Başlamak için, izole edilmiş sıçan NET örneklerinin 50 mikrolitresini 450 mikrolitre Tris-EDTA tamponu içeren bir tüpe pipetleyin. Şimdi 100 mikrolitre DNA standartlarını ve numuneleri 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin. Kuyucuklara eşit hacimde tahlil reaktifi ekleyin.
Ardından, doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçınarak plakayı oda sıcaklığında iki ila beş dakika inkübe edin. Plakayı bir floresan mikroplaka okuyucusuna yerleştirin. Yaklaşık 530 nanometrelik bir emisyon spektrumu ve yaklaşık 480 nanometrelik bir emici spektrum ayarlayın.
Hücreleri bir mikrolitre çekirdek boyasında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri bir mikrolitre hücresiz DNA suşunda 10 dakika boyunca inkübe edin. Floresan boyaları yavaşça karıştırın.
S'yi yükleyinampleto sitometre. SYTOX Green kanalına geçin, ardından HEXT kanalını seçin. Aydınlatmayı Mavi 377/447 olarak ayarlayın ve pozlama süresini 300.000 mikrosaniyeye ayarlayın.
Odaklanmış Kurulum'a tıklayın ve ardından odağı otomatik olarak ayarlamak için Otomatik Kaydet'e tıklayın. SYTOX Yeşil kanalını seçin ve aydınlatmayı Yeşil 483/536 olarak ayarlayın. SYTOX Green için pozlama süresini 30.000 mikrosaniye olarak ayarlayın.
Tarama işlemini başlatmak için Taramayı Başlat'a tıklayın. NET sekresyonunda karşılaştırılabilir yanıtlar, PMA stimülasyonundan bağımsız olarak periferik ve kemik iliği nötrofilleri arasında fark edilebilirdi. Sıçan NET'leri ayrıca birbirleriyle sınırlı çapraz bağlantı yetenekleri sergiledi.
PMA ile inkübasyon, dört saat sonra hücresiz DNA içeriğinde% 10'luk bir artışa yol açtı ve bu da NET oluşumunu tetikleme eğiliminin daha yüksek olduğunu gösterdi.
