Başlamak için, PBS ile perfüze edilmiş kafası kesilmiş bir farenin omuriliğini çıkarın. Omuriliği soğuk DPBS'ye batırın, buz üzerinde bir Petri kabına daldırın. 18 gauge iğne ve soğuk DPBS ile doldurulmuş 10 mililitrelik bir şırınga ile, tüm omuriliği laminer akış başlığında izole etmek için hidrolik ekstrüzyon kullanın.
Omuriliği, buz paketleri üzerine yerleştirilmiş soğuk DPBS ile Petri kabına aktarın. Laminer akış başlığının içinde bir mikroskop kullanarak, görünür meninksleri keskin forseps ile dikkatlice çıkarın. Ardından, omuriliği boş bir Petri kabına aktarın ve iki ila üç milimetre uzunluğunda bölümlere ayırmak için No.10 cerrahi neşter bıçağı kullanın.
Omurilik hücrelerinin enzimatik ayrışması için, omurilik parçalarına Enzim Karışımları 1 ve 2 ekleyin. Omuriliğin düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlamak için çanaktaki enzimleri birkaç kez döndürün. Çanağı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, çanağı her 10 dakikada bir manuel olarak döndürün.
İnkübasyondan sonra, 350 mikrolitre DNAse ekleyin. Ardından, hafifçe karıştırmadan önce% 0.5 FBS ile desteklenmiş bir mililitre soğuk DMEM ekleyin. Tüm içeriği hemen beş mililitrelik bir tüpe aktarın.
Bir P1000 pipeti ile dokuyu üç kez nazikçe ezin. Ardından, dokuyu beş kez daha nazikçe ezmek için tıkalı dokuz inçlik bir cam Pasteur pipeti kullanın. Dokunun yerleşmesini sağlamak için tüpü 30 saniye dik olarak yerleştirin.
Bir P1000 pipeti ile süpernatanı aspire edin ve 30 mikrometrelik bir filtreden 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Kalan dokuların bulunduğu tüpe, bir mililitre FBS takviyeli DMEM ekleyin. Ardından, bir Pasteur pipeti ile üç kez hafifçe ezin.
Dokunun dibe çökmesine izin verdikten sonra, süpernatanı 30 mikrometrelik bir filtreden geçirin ve daha önce kullanılan aynı 15 mililitrelik tüpe toplayın. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atmak için bir vakum aspiratörü kullanın.
Miyelini hücre peletinden çıkarmak için yetişkin beyin ayrışma kitinde sağlanan enkaz temizleme solüsyonunu kullanın. Ardından, pelete beş mililitre FBS takviyeli DMEM ekleyin ve karıştırmak için tüpü üç kez hafifçe ters çevirin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini bir mililitre FBS takviyeli DPBS içinde yeniden süspanse edin.
Süpernatanı atmadan önce tekrar santrifüjleyin. Hücreleri, üreticinin protokolüne göre Anti-ACSA-2 MicroBeads ile etiketledi. Hücreleri pozitif seçimle ayırmak için manyetik ayırma sütunlarını kullanın.
Ardından, süpernatanı atmadan önce hücreleri 300 g'da 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, hücre peletini bir mililitre sıcak FBS takviyeli DMEM'de yeniden süspanse edin. Hücreleri saymak ve canlılıklarını değerlendirmek için hücre süspansiyonunu bir hemositometreye aktarın.
FBS DMEM ile hücre konsantrasyonunu 50 mikrolitre başına 75.000 hücreye ayarlayın. Daha sonra, 50 mikrolitre hücre süspansiyonunu 24 oyuklu bir plakada poli-l-lizin kaplı bir lamel üzerine aktarın. Hücrelerin lamel üzerine yapışmasını sağlamak için plakayı iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ardından, her bir oyuğa dikkatlice 450 mikrolitre ılık ve antibiyotik takviyeli FBS DMEM ekleyin. Mikroglia ve astrositlerin başarılı izolasyonu ve proliferasyonu gözlendi. Dördüncü günde, astrositlerin daha uzun süreçler oluşturduğu gözlemlenirken, daha kısa iğciklere sahip oval mikroglial hücreler görüldü.
Astrositler, yedinci günde birbirine bağlı bir birleşik katman oluşturdu ve mikroglia daha az ve daha kısa süreçler gösterdi. Hücre sınıflandırması, izole edilen hücre kültürünün %92 ila %93 hücre canlılığını doğruladı.
