Başlamak için, inkübe etmeden önce 150 mikrolitre% 0.01 ila% 0.1 hücre bağlantı çözeltisi ile bir mikro kuyu kabını kaplayın. Çanak havayla kuruduktan sonra, kuru yüzeye damla damla 80 mikrolitre altın nano parçacık çözeltisi ekleyin. Ertesi gün, eklenen herhangi bir kültür ortamını mikro kuyudan çıkarın.
Daha sonra, cam yüzeydeki hareketsizleştirilmiş altın nano parçacıkların üzerine iki mililitre transfekte edilmiş hücre ekleyin. Deney başlamadan önce plakayı inkübe edin. Annexin proteininden GFP floresansını görüntülemek için 488 nanometreye ayarlanmış bir organ lazeri ile konfokal bir mikroskop kullanın.
Altın nano parçacık yansımasını gözlemlemek için helyum neon lazeri 633 nanometreye ayarlayın. Plazma zarlarının üst üste binmesini önlemek için hücre kümeleri yerine tek hücreleri seçin. Hareketsizleştirilmiş altın nano parçacıkların tek parçacıklar olarak bulunduğundan ve termal gradyanların artmasını önlemek için yeterli aralıklarla yerleştirildiğinden emin olun.
Plazma zarını bozmak için altın nano parçacığı bir saniye ışınlamak için optik cımbız kullanın. Dev unilamellar veziküller veya GUV oluşturmak için, bir cam slayt üzerine 90 mikrolitre ısıtılmış% 5 PVA jeli uygulayın. Jeli slaytın üzerine eşit şekilde yayın.
Ardından slaytı 50 santigrat derecede bir ısıtma kabininde 50 dakika kurumaya bırakın. Daha sonra, 30 mikrolitre lipit karışımı uygulamak için bir cam şırınga kullanın. İğne kenarı ile karışımı ince bir filme yayın.
Lipid karışımının kloroformunu buharlaştırmak için hafif bir nitrojen gazı akışı uygulayın. Daha sonra slaytları vakum altında 1,5 ila 2 saat kurutun. İki mililitrelik ayrı bir tüpte, 400 mikrolitre büyütme tamponu ekleyin.
Daha sonra, ilgilenilen rekombinant proteini 500 nano molar'lık bir son konsantrasyona ekleyin. Seyreltilmiş proteinden 400 mikrolitreyi monte edilmiş kurum içi hazneye pipetleyin ve hazneyi PERIFIL'e sarın. Bir saatlik inkübasyondan sonra, hazne içeriğinin 400 mikrolitresini iki mililitrelik bir tüpe aktarın.
Kapsüllenmemiş proteinleri çıkarmak için toplanan çözeltiye bir mililitre gözlem tamponu ekleyin. Daha sonra çözeltiyi 600 G'de 13 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatantın bir mililitresini gözlem tamponu ile değiştirin ve GUV'leri dağıtmak için hafifçe pipetleyin.
Deneyin başlangıcına kadar soğutun. GUV'u delmek için önce 35 milimetrelik bir cam tabanlı çanağın yüzeyini beta kazein ile kaplayın. Daha sonra, kalsiyum klorür içeren GUV karışımına 5 mikrolitre 150 nanometre altın nano kabuk ekleyin.
Karışımı hazneye aktarın ve mikroskop tablasına monte edin. GUV yüzeyinde tek bir altın nano kabuğu yakalamak için optik cımbızı kullanın. Sıkışan nano kabuk GUV membranı ile yakın temas halindeyken, hedef bölgeyi delmek için lazer gücünü artırın.
Nano parçacık ışınlaması, bir membran yaralanmasına neden oldu ve halka benzeri bir yapı oluşturmak için kalsiyum akışını takiben yaralanma bölgesine hızlı bir şekilde annexin alınmasına neden oldu. GUV deneylerinde, membran ponksiyonu, eklerin yokluğunda hızla yeniden kapatıldı. Annexin A 4 proteininin benzersiz biyofiziksel özellikleri, membranları yuvarlama kabiliyeti nedeniyle GUV'nin patlamasına neden oldu.
GUV'lerde annexin varlığı, membran delinmesini takiben yaralanma bölgesinde hızlı bir birikime neden oldu. Hücre deneylerinde annexin A 5 halkalarının analizi, zaman ve mekanda sabit kaldıklarını gösterdi. Termoplazmonik kullanılarak plazma zarının bozulması, kalsiyum iyon seviyelerinin yükselmesine neden oldu.
Hücreler, yaranın kapanma zamanına karşılık geldiği varsayılan bir zaman noktası olan 6.6 saniyede maksimum kalsiyum yoğunluğuna ulaştı.
