Başlamak için, yeni eksize edilmiş insan omentumunu bir laminer akış başlığı içindeki toplama kabından çıkarın. Kalan kan veya kalıntıları nazikçe yıkamak için omentumu PBS'ye daldırın. Bir neşter ve forseps kullanarak dokuyu parçalara ayırın.
Omentum parçalarını 24 oyuklu bir kültür plakasının ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Daha sonra kuyucukları 500 mikrolitre omentum kültür ortamı ile doldurun. % 75 birleşik insan mCherry pozitif yumurtalık kanseri hücreleri içeren bir kültür şişesine 10 mililitre steril PBS ekleyin.
Hücreleri yıkamak için şişeyi hafifçe sallayın. PBS'yi çıkarın ve üç mililitre% 0.05 tripsin EDTA ekleyin. Tripsin EDTA'yı bağlı hücrelere eşit olarak dağıtmak için kültür şişesini tekrar hafifçe sallayın.
Daha sonra şişeyi% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede beş dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Bundan sonra, şişeyi inkübatörden çıkarın. Şimdi hücreleri tamamen ayırmak için kültür şişesine dokunun.
Daha sonra tripsini nötralize etmek için üç mililitre omentum kültür ortamı ekleyin. İyice karıştırmak için hücre süspansiyonunu birkaç kez pipetleyin. Süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Süspansiyonu 1.200 G'de 24 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Şimdi süpernatanı pipetleyin ve hücre peletini altı mililitre taze omentum kültür ortamında yeniden süspanse edin. Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak için 10 mikrolitre hücre süspansiyonu alın.
Hücre süspansiyonunu taze kültür ortamı ile gerekli yoğunluğa seyreltin. Bir mililitrelik bir şırınga ile kanser hücresi süspansiyonunu hazırlayın. Şırıngaya 26 gauge iğne takın.
Şimdi kesilmiş omentumdan bir parça almak için bir çift küçük cerrahi forseps kullanın ve omentum parçasını ayrı bir çalışma steril kabına yerleştirin. Daha sonra dokuya yaklaşık 100 mikrolitre kanser hücresi süspansiyonu enjekte edin. Alternatif olarak, eşit hacimlerde çözülmüş bazal membran matrisini omentum kültürü ile karıştırın.
Karışımı enjeksiyona kadar buz üzerine koyun. Omentum parçalarını kültür plakasının kuyucuklarındaki matris karışımına daldırdıktan sonra, plakayı 20 dakika inkübe edin. Bundan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın.
Karışım katılaştıktan sonra, omentum parçalarına kanser hücrelerini enjekte edin. Floresan görüntüleme kullanarak kanser hücrelerinin başarılı bir şekilde enjekte edildiğini onaylayın. Enjeksiyon bölgelerinde onay olarak bir floresan sinyal çizgisi görülebilir.
Omentum ve kanser hücrelerinin birlikte kültürünü kolaylaştırmak için, her 48 ila 72 saatte bir 500 ila 200 mikrolitre taze ortam ekleyin. Son olarak, bir floresan mikroskobu kullanarak yumurtalık kanseri tümörlerinin büyümesini izleyin. Tümör büyümesi iki hafta içinde görülebilir.
Yumurtalık kanseri hücreleri, 14. günde omentum parçalarına başarıyla entegre edildi. Kanser hücreleri başlangıçta ilk haftada omentum yüzeyine yayıldı. Zamanla, hücreler tümörleri oluşturmak için toplandı.
Tümör yükü, kırmızıdan sarıya dönen omentum ortamının renk değişimi ile doğrulandı.
