Başlamak için, L3 evresi Drosophila larvalarını soğuk PBS'de her biri beş dakika boyunca üç kez durulayın. İki çift keskin forseps kullanarak larvaların ön kısmını tutun ve vücut dokularının yaklaşık 2 / 3'ünü çıkarın. Larvaların ilk 1 / 3'ünü bir çift forseps ve diğer çiftle ağız kancaları ile tutun.
Ardından, larvalar tamamen ters çevrilene kadar larvaların içindeki ağız kancalarını geri çekin. Trakeaya bağlı bir çift kanat diski ile temiz bir ters çevrilmiş larva karkası elde etmek için bacak disklerini ve beyni çıkarın. Kanat disklerini bir mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.
Kanat disklerini, çalkalama altında oda sıcaklığında 45 dakika boyunca PBS'de seyreltilmiş% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Fiksasyondan sonra, numuneleri her biri% 70 etanol ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Anestezi uygulanmış sineklerin başlarını, karınlarını, bacaklarını ve kanatlarını çıkarın ve diseke edilmiş toraksları soğuk PBS'ye yerleştirin.
Toraksı, çalkalama altında 20 dakika boyunca% 1 Triton içinde seyreltilmiş% 4 paraformaldehit içinde önceden sabitleyin. Daha sonra numuneleri çalkalama altında PBT kullanarak her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Göğüs kafeslerini bir cam slayt üzerinde çift taraflı bir bant üzerine yerleştirin ve iki hemitorat üretmek için keskin bir mikrotom bıçağı kullanarak ikiye bölün.
Hemitrakesleri çalkalama altında 45 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Numuneleri çalkalama altında PBT kullanarak her biri 20 dakika boyunca iki kez yıkayın. Hemitoraces'i soğuk PBS'ye yerleştirin ve dolaylı uçuş kaslarını hemithoraces'ten dikkatlice izole etmek için forseps kullanın.
Kasları dört santigrat derecede iki ila yedi gün boyunca% 70 etanol içinde geçirgenleştirin. Geçirgenlikten sonra, IFM'leri tampon A kullanarak her biri 20 dakika boyunca iki kez yıkayın.Daha sonra 400 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin ve kasları bir termal karıştırıcıda 37 santigrat derecede 30 dakika önceden hibridleyin. Prob ve birincil antikoru içeren 100 mikrolitre taze hazırlanmış hibridizasyon tamponu ekleyin.
Numuneleri karanlıkta 37 santigrat derecede 16 saat boyunca bir termal karıştırıcıda 300 RPM'de inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri her biri 10 dakika boyunca ılık tampon A kullanarak üç kez yıkayın. Daha sonra numuneleri ikincil antikor ve DAPI tamponu A içinde 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.
Numuneleri bir mikroskop lamına aktarmadan önce her biri 20 dakika boyunca tampon B ile üç kez yıkayın. Kalan tamponu B silin ve kızağa 30 mikrolitre montaj ortamı ekleyin. Sürgünün üzerine 18 x 18 milimetrelik bir kapak fişi yerleştirin ve oje kullanarak kapak fişini kapatın.
