40x ve 63x yağa daldırma objektifleri ile donatılmış konfokal mikroskobu açtıktan sonra, slaydı mikroskop tablasına yerleştirin. Kanat diski ile ilişkili kas progenitörlerini ve dolaylı uçuş kaslarını veya IFM'leri görüntülemek için, DAPI'yi 405 uyarma ve 450 nanometre emisyon ile ayarlayın. Ardından, 496 uyarma ve 519 nanometre emisyon ile Alexa Fluor 488'i ve 647 uyarma ve 670 nanometre emisyon ile smFISH probları için Quasar 670'i seçin.
Bir DAPI sinyali ve UV lambası kullanarak numuneyi bulun. Yakalanan görüntüleri TIFF dosyaları olarak kaydedin. Yetişkin kas kök hücrelerini görüntülemek için, daha önce gösterildiği gibi DAPI ve Alexa Fluor 488 için uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın.
Ardından smFISH probları için Alexa Fluor 555 ve Quasar 670 dalga boylarını ayarlayın. Örneği bulun ve yakalanan görüntüleri TIFF olarak kaydedin. J görüntüsünü başlatın ve eklentiler menüsüne gidin.
Makrolar'ı ve ardından Düzenle'yi seçerek makroların kaynak kodunu açın. Larvalardaki Mef2 smFISH lekelerini ölçmek için log yarıçapını üçe ve log kalitesini 20'ye ayarlayın. Daha sonra Mef2 pozitif çekirdekleri iki bulanıklık, 30 çekirdek ölçeği parametresi, eksi sekiz çekirdek eşiği ve 300 çekirdek boyutu ile bölümlere ayırın.
Çalıştır komutunu yürüterek makroyu başlatın. Makro, belirlenen klasördeki tüm görüntüleri otomatik olarak yükleyecek ve bunları sırayla ölçecektir. Kas liflerinde log yarıçapını 2,5'e, log kalitesini 60'a, bulanıklığı ikiye, çekirdek ölçeği parametresini 100'e, çekirdek eşiğini sıfıra ve çekirdek boyutunu 300'e ayarlayın.
Çalıştır komutunu yürüterek makroyu başlatın. Makro, belirlenen klasördeki tüm görüntüleri otomatik olarak yükleyecek ve bunları sırayla ölçecektir. Analizden sonra, dosya FISH sonuçlarında ve dosya çekirdeği sonuçlarında görüntülenen sonuçları kontrol edin.
Mef2 ve Zfh1 transkriptleri, AMP popülasyonunda homojen olarak tespit edildi ve sırasıyla Mef2 ve Zfh1 proteinleri ile birlikte lokalize edildi. AMP'lerin daha yüksek bir büyütmesi, transkripsiyon bölgeleri odakları ile sitoplazmaya dağılmış olgun mRNA arasında ayrım yaptı. Benzer şekilde, farklılaşmış yetişkin IFM'lerde ve ilişkili kök hücrelerde Mef2 ve Zfh1 mRNA'nın transkripsiyon yeri ve dağılımı incelendi.
Şirket içi yerleşik görüntü J makrosu, Mef2 lekelerini ve kas çekirdeklerini etkili bir şekilde tespit etti ve bölümlere ayırdı. Yetişkin IFM'lerde ve AMP'lerde çekirdek başına Mef2 mRNA'nın kantitatif analizi önemli ölçüde farklı değildi. Mef2 spot dağılımının nicelleştirilmesi, Mef2 mRNA'nın %92'sinin sitoplazmada bulunduğunu ve %8'inin kas çekirdeği ile ilişkili olduğunu gösterdi.
