Başlamak için, laminer akış başlığına yerleştirilen pipet istasyonunun parametrelerini bir darbede 1.900 volt, 20 milisaniyeye ayarlayın. Steril tutmak için bir transfeksiyon tüpünü paketten dikkatlice çıkarın ve üç mililitre E tamponu ile doldurun. Hücreleri elektroporasyona hazırlamak için, büyüme ortamını hücrelerden çıkarın ve yapışmayı destekleyen serum ve iki değerlikli katyonları çıkarmak için PBS kullanarak yıkayın.
Daha sonra hücrelere bir PBS ve bir milimolar EDTA karışımı ekleyin ve hücreler ayrılmaya başlayana kadar oda sıcaklığında yaklaşık beş dakika inkübe edin. Hücreleri ayırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücreleri düşük protein bağlayıcı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri beş dakika boyunca 500 G'de pelet haline getirin.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatantın çoğunu hızlı bir şekilde çıkarın ve tüpte yaklaşık bir mililitre süpernatan bırakın. Kalan süpernatanttaki hücreleri yeniden süspanse edin ve düşük protein bağlayıcı 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Kalan hücreleri beş dakika boyunca oda sıcaklığında 500 G'de santrifüj ederek saymak ve peletlemek için küçük bir hücre alikotunu çıkarın.
Santrifüjleme sırasında hücreleri sayın. 20 milimolar Cas9 çözeltisinde 1x sgRNA alın ve tüpleri oda sıcaklığına ısıtın. Santrifüjlemeden sonra, tüm süpernatanı hücre peletinden çıkarın ve PBS'deki hücreleri mililitre başına 40 milyon hücre konsantrasyonunda kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile yeniden süspanse edin.
sgRNA Cas9 ribonükleoprotein kompleksi düzeneği için, sterilize edilmiş PCR tüplerinde seyreltilmiş Cas9'un bir mikrolitresine 2,5 mikrolitre sgRNA ekleyin ve çökelmeyi önlemek için sgRNA'yı yaklaşık 15 saniye karıştırarak yavaşça dağıtın. Ribonükleoprotein kompleksi oluşumuna izin vermek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ribonükleoprotein kompleksini elektroporasyon yoluyla iletmek için, gövdeyi uzatmak için pistona bastırarak elektroporasyon ucunu hazırlayın.
Ardından sapı uca yerleştirin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin. Elektroporasyon ucunu hücrelerle doldurun ve ucun tam 10 mikrolitre hacim kapasitesini geri çekin.
Negatif kontrol sgRNA'sından başlayarak, elektroporasyon ucundaki 10 mikrolitre hücreyi 3.5 mikrolitre ribonükleoprotein içeren numune tüpüne aktarın. İyice karıştırmak için üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve karışımın 10 mikrolitresini tekrar uca çekin. Ucu elektroporasyon istasyonuna yerleştirin, tampona indirin ve dokunmatik ekranda Başlat düğmesine basın.
Tamamlandıktan sonra, ekran başarılı bir darbe gösterecektir. Pipeti cihazdan çıkarın ve hücreleri kaplanmamış 12 oyuklu plakanın kuru bir kuyusuna yerleştirin. Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren 15 mililitre PBS'de iki kez yukarı ve aşağı pipetleyerek ucu durulayın.
Pipeti, ucu takılıyken bir kenara koyun. Hücrelere daha önce alıntılanmış antibiyotik içermeyen besiyerinden hemen bir mililitre ekleyin ve karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın. Düzenlenmiş makrofajlarda kontrollü bir hedeflemesiz sgRNA Cas9 ribonükleoproteini, Rosa 26 spesifik sgRNA ve Src ve Cblb genleri ile elektropore edilmiş kemik iliği kaynaklı makrofajlardan Rosa 26 lokusunun temsili Sanger dizileme kromatogramı burada gösterilmektedir.
Hedeflenen genlerin PCR ve Sanger dizilimi ile analizi, Cas9 bölünme bölgesinin akış aşağısındaki her pozisyonda çoklu nükleotidleri gösterir. Bu sonuçlar, birden fazla hedeflenen gen için yüksek bir düzenleme verimliliğinin elde edildiğini doğrulamaktadır.
